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Discovery of an extended austinoid biosynthetic pathway in Aspergillus calidoustus

作者
Vito Valiante, Derek J. Mattern, Anja Schüffler, Fabian Horn, Grit Walther, Kirstin Scherlach, Lutz Petzke, Joachim Dickhaut, Reinhard Guthke, Christian Hertweck, Markus Nett, Eckhard Thines, Axel A. Brakhage
单位
Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Jena, Germany; Friedrich Schiller University, Jena, Germany; Institute of Biotechnology and Drug Research, Kaiserslautern, Germany; Johannes-Gutenberg-University Mainz, Institute of Biotechnology, Mainz, Germany; Systems Biology and Bioinformatics, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Jena, Germany; German National Reference Center for Invasive Fungal Infections, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Jena, Germany; Department of Biomolecular Chemistry, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Jena, Germany; BASF SE, Ludwigshafen, Germany; Research Group Secondary Metabolism of Predatory Bacteria, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Jena, Germany
杂志
ACS Chemical Biology（2017）
DOI
10.1021/acschembio.7b00003
所属领域
合成生物学
关键词
Aspergillusaustinoidsgenome miningmeroterpenoidsnatural products
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解决的核心问题

在 Aspergillus calidoustus 中发现并解析扩展的 austinoid 生物合成途径，包括新衍生物及其生物合成基因，特别是非迭代二酮合酶 AusV 的功能和新型聚酮-萜类杂合物的形成机制。

研究策略

通过基因组挖掘鉴定推定的 austinoid 生物合成基因簇；利用缺失非同源末端连接修复基因 akuB 的菌株提高转化效率，结合基因敲除、HPLC-HRMS 代谢谱分析、NMR 结构解析、系统发育分析等方法，逐一验证新基因在途径中的功能。

研究路线图

100%
研究问题：
发现并解析扩展的
austinoid生物合成途径
策略：
基因组挖掘+基因敲除
结合代谢谱分析
关键改造1：
敲除akuB基因
转化效率提高80%
关键改造2：
表征非迭代二酮合酶AusV，
合成tiglate侧链
关键改造3：
混杂酰基转移酶AusQ，
直接加载聚酮到骨架
关键改造4：
敲除ausO/P/R/T，
验证各步催化功能
结果：
22个基因参与生物合成，
新化合物7对桃蚜致死率100%
结论：
揭示新型聚酮-萜杂合物
形成机制，提供杀虫候选分子
创新点：
新基因簇、AusV、AusQ、
新化合物7及杀虫活性
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核心内容

本研究通过基因组挖掘在 Aspergillus calidoustus 中发现了一个扩展的 austinoid 生物合成基因簇，包含约 25 个基因，其中 22 个被证实参与生物合成。利用缺失非同源末端连接修复基因 akuB 的菌株将转化效率提高约 80%，结合基因敲除、HPLC-HRMS 代谢谱分析和 NMR 结构解析，逐一解析了各基因的功能。首次发现并表征了非迭代二酮合酶 AusV，该酶与洛伐他汀合酶 LovF 氨基酸同一性仅 33%，其 KS 结构域在系统发育上处于独特分支，负责合成 tiglate 侧链并直接连接到 meroterpenoid 骨架上；同时证明酰基转移酶 AusQ 具有底物混杂性，是首个将聚酮直接加载到 meroterpenoid 上的酶。敲除系列实验明确了各基因在途径中的分工，如 ΔausA 完全失去 austinoid 产生能力，敲除 ausR 导致新产物 1,2-二氢-脱氢austin 的积累。研究还鉴定了新化合物 calidodehydroaustin，其与 dehydroaustin 对桃蚜致死率均达 100%，且 calidodehydroaustin 显示出物种特异性杀虫活性。这些发现扩展了 austinoid 生物合成途径的已知范围，揭示了新型聚酮-萜类杂合物的形成机制，为天然产物生物勘探和新型杀虫剂开发提供了候选分子。

创新点

['在 A. calidoustus 中发现了扩展的 austinoid 生物合成途径，该基因簇包含 5 个 A. nidulans 中不存在的基因', '首次发现并表征了非迭代的聚酮合酶 AusV，其作为二酮合酶仅合成 tiglate 侧链，并直接连接到 meroterpenoid 骨架上', '证明酰基转移酶 AusQ 具有底物混杂性，既能转移乙酰基，也能转移聚酮产物，是首个将聚酮直接加载到 meroterpenoid 上的例子', '鉴定了新化合物 calidodehydroaustin (7) 并发现其具有杀虫活性，对桃蚜致死率 100%']

研究对象（10）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausA AusA 催化 非还原型聚酮合酶，负责合成起始底物3,5-二甲基苔色酸
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausN AusN 催化 异戊烯基转移酶，负责法尼基化步骤
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausP AusP 催化 O-乙酰转移酶，催化austinol (1) C-11位乙酰化生成austin (2)
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausQ AusQ 催化 混杂O-乙酰转移酶，既能转移乙酰基也能转移聚酮链，催化生成1,2-dehydro-precalidodehydroaustin (13)
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausR AusR 催化 细胞色素P450单加氧酶，催化C-7位羟基化生成7-羟基脱氢austin (4)
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausS AusS 调控 推测为调控因子，敲除后完全丧失austinoid产生，但未发现已知调控基序
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausT AusT 催化 孕酮5-β-还原酶类似蛋白，催化C-1/C-2双键还原
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausV AusV 催化 非迭代高度还原型聚酮合酶（二酮合酶），合成(E)-2-甲基-2-丁烯酸（tiglate）侧链
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausO AusO 催化 2OG-Fe(II)双加氧酶，催化C-2位羟基化生成calidodehydroaustin (7)及1,2-二氢-2-羟基-乙酰氧基脱氢austin (12)
Aspergillus calidoustus austinoid/meroterpenoid biosynthesis ausY AusY 转运 主要促进子超家族转运蛋白，推测参与产物外排

关键发现

  1. 通过对 A. calidoustus 中 austinoid 生物合成途径的研究，发现该基因簇包含约 25 个基因，其中 22 个被证实参与生物合成。ΔausA 突变体完全失去 austinoid 产生能力，ΔausN 仅产生早期产物 3,5-二甲基苔色酸。敲除 ausP 导致 austin (2) 完全缺失
  2. 敲除 ausQ 不影响 2 和 3 的产生
  3. 敲除 ausR 导致 7-羟基脱氢austin (4) 缺失，积累新产物 1,2-二氢-脱氢austin (9)
  4. 敲除 ausV 证实其负责合成 tiglate 侧链并生成 precalidodehydroaustin (6)、calidodehydroaustin (7) 和 1,2-dehydro-precalidodehydroaustin (13)
  5. 敲除 ausO 导致 7 缺失，但可催化 11 的羟基化生成 12。AusV 与洛伐他汀合酶 LovF 氨基酸同一性仅 33%，且其 KS 结构域系统发育分析显示为独特分支。杀虫活性测试中，austin (2) 对桃蚜 Myzus persicae 致死率 75%
  6. dehydroaustin (3) 对桃蚜和豆蚜 Megoura viciae 均为 100%，对棉铃象甲 Anthonomus grandis 为 50%
  7. calidodehydroaustin (7) 对桃蚜致死率 100%，显示出物种特异性。利用 akuB 缺失菌株可使靶向转化效率提高约 80%。

研究结论

本研究在 A. calidoustus 中扩展了已知的 austinoid 生物合成途径，鉴定了包括非迭代二酮合酶 AusV 和混杂酰基转移酶 AusQ 在内的新酶，揭示了新型聚酮-萜类杂合物的形成机制，并获得具有物种特异性杀虫活性的新化合物，为天然产物的生物勘探和新型杀虫剂开发提供了候选分子。