Trichodiene Synthase. Identification of Active Site Residues by Site-Directed Mutagenesis†
- 作者
- David E. Cane, Jae Hoon Shim, Qun Xue, Brian C. Fitzsimons, Thomas M. Hohn
- 单位
- Department of Chemistry, Box H, Brown University, Providence, Rhode Island 02912; Mycotoxin Research Unit, USDA/ARS, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois 61604
- 杂志
- Biochemistry（1995）
- DOI
- 10.1021/bi00008a011
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定 trichodiene synthase（单端孢霉二烯合酶）活性位点的氨基酸残基，并阐明其在底物结合和催化中的功能。
研究策略
利用巯基化学修饰（MMTS、DTNB）标记并鉴定活性位点半胱氨酸，通过定点突变构建 C146A、C190A 及碱性富集区（DRRYR，302-306）系列突变体，结合动力学参数测量和 GC-MS 产物分析确定关键残基的作用。
核心内容
该研究通过定点突变系统鉴定了单端孢霉二烯合酶（trichodiene synthase）活性位点的关键氨基酸残基。作者首先利用巯基化学修饰（MMTS、DTNB）标记活性位点半胱氨酸，随后构建了C146A、C190A及碱性富集区DRRYR（302-306）系列突变体，结合动力学参数测量和GC-MS产物分析确定各残基功能。结果表明，C190A突变体的kcat/Km比野生型降低约3000倍，C146A突变体基本失活，证明这两个半胱氨酸对催化至关重要。碱性区中，R304K突变体Km增加约25倍（1500 nM对68.2 nM），kcat降低约200倍，kcat/Km下降超过4000倍，且产物中出现至少两种异常C15H24烃；Y305F突变体kcat约为野生型的三分之二，Km增加6至8倍，而Y305T突变体kcat降低约120倍，产物变为trichodiene与未知倍半萜烃约1:1的混合物。化学修饰实验显示MMTS可灭活酶，DTNB滴定测得每个亚基含6.9个半胱氨酸，其中天然酶有5.9个可被滴定。这些结果揭示了Cys146、Cys190、Arg304和Tyr305在底物结合与环化反应中的关键作用，为理解萜类环化酶的活性位点结构与催化机制提供了重要证据，并表明这些残基的突变会显著影响酶活性甚至改变产物谱。
创新点
首次通过定点突变鉴定了倍半萜合酶（trichodiene synthase）中的活性位点半胱氨酸（Cys146、Cys190）；揭示了碱性区 Arg304 和 Tyr305 对底物结合和催化的重要作用；发现突变体可产生异常环化产物，为理解萜类环化酶活性位点结构提供了新证据。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 (wild-type) | Trichodiene synthase (TS1) | 催化 | 催化 FPP 环化生成 trichodiene，kcat=0.32 s^-1，Km=68.2 nM |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 C146A | C146A trichodiene synthase | 催化 | 基本失活，kcat 约 10^-6 s^-1 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 C190A | C190A trichodiene synthase | 催化 | kcat/Km 降低约 3000 倍，kcat=1.44×10^-4 s^-1，Km=91.1 nM |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | hybrid TS1 (Fs 1-309 / Gp 310-383) | hybrid trichodiene synthase | 催化 | 动力学与野生型几乎相同，Km=54.3 nM，kcat=0.23 s^-1 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 R304K | R304K trichodiene synthase | 催化 | Km=1500 nM（增加约 22 倍），kcat=1.44×10^-3 s^-1（降低约 200 倍），产生额外 C15H24 烃 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 Y305F | Y305F trichodiene synthase | 催化 | kcat=0.20 s^-1（约为野生型 2/3），Km=433 nM（增加约 6 倍），主要产物为 trichodiene，含 <5% 副产物 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成（trichodiene 合成） | TS1 Y305T | Y305T trichodiene synthase | 催化 | kcat=1.96×10^-3 s^-1（降低约 120 倍），Km=4500 nM（增加约 80 倍），产物为 trichodiene 和未知 C15H24 烃约 1:1 |
关键发现
- C190A 突变体的 kcat/Km 比野生型降低约 3000 倍（kcat 降低约 2000 倍，Km 增加
- 3 倍），C146A 突变体基本失活（kcat 约 10^-6 s^-1）。R304K 突变体 Km 增加约 25 倍（1500 nM vs
- 2 nM），kcat 降低约 200 倍（1.44×10^-3 s^-1），kcat/Km 降低超过 4000 倍，且产物除 trichodiene 外还有至少两种 C15H24 烃。Y305F 突变体 kcat 约为野生型的 2/3，Km 增加约 6-8 倍。Y305T 突变体 kcat 降低约 120 倍，Km 增加约 80 倍，产物为 trichodiene 与未知倍半萜烃约 1:1 的混合物。化学修饰实验显示 MMTS 可灭活酶，表现 K1 约
- 60 mM，kinact 约
- 17 min^-1；DTNB 滴定显示每个亚基有
- 9 个半胱氨酸，天然酶有
- 9 个可滴定。
研究结论
trichodiene synthase 的活性位点包含 Cys146、Cys190 以及碱性富集区 302-306 中的 Arg304、Tyr305 等关键残基；其中 Cys190 和 Cys146 对催化至关重要，Arg304 和 Tyr305 参与底物结合与催化，这些残基的突变会导致酶活性显著下降甚至产物谱改变。