Threonine 246 at the Active Site of the L-Lactate Dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus Is Important for Catalysis but Not for Substrate Binding†
- 作者
- Roman Sakowicz, Helmut K. W. Kallwass, Wendy Parris, Cyril M. Kay, J. Bryan Jones, Marvin Gold
- 单位
- Department of Molecular and Medical Genetics and Department of Chemistry, University of Toronto; Department of Biochemistry, University of Alberta
- 杂志
- Biochemistry（1993）
- DOI
- 10.1021/bi00210a023
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Bacillus stearothermophilus L-乳酸脱氢酶活性位点Thr246残基在催化中的作用，确定其羟基是否参与底物结合或催化
研究策略
通过定点突变将Thr246分别突变为缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸，结合稳态动力学、单周转动力学、动力学同位素效应和圆二色光谱分析，评估突变对催化和底物结合的影响
核心内容
该研究通过定点突变将嗜热脂肪芽孢杆菌L-乳酸脱氢酶活性位点的Thr246分别替换为缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和丝氨酸，结合稳态动力学、单周转动力学、动力学同位素效应及圆二色光谱，系统评估该残基在催化与底物结合中的角色。结果显示，T246A和T246V的kcat/KM较野生型（4.2×10⁶ M⁻¹ s⁻¹）降低约40倍，而T246S仅下降约2倍，表明羟基对催化至关重要；但T246A和T246V对丙酮酸的KM并未升高，且NADH表观KM反而降低约20倍，说明该残基不参与底物生产性结合。单周转动力学显示T246A的速率常数（5.7 s⁻¹）远低于野生型（235 s⁻¹），其氘动力学同位素效应升至2.4（野生型为1.12），提示氢化物转移步骤受阻。此外，T246A和T246V催化羟基丙酮酸的kcat为丙酮酸的5–8倍，支持该羟基通过稳定NADH二氢烟酰胺环正电荷促进氢化物转移的机制。该工作阐明了Thr246在催化而非底物结合中的关键作用，为乳酸脱氢酶的理性改造提供了结构基础。
创新点
发现Thr246的羟基对催化至关重要但并非底物结合所必需；提出该羟基通过稳定NADH二氢烟酰胺环上的正电荷促进氢化物转移
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TG2 | 乳酸代谢（丙酮酸还原为L-乳酸） | BSLDH基因 | L-乳酸脱氢酶 (EC 1.1.1.27) | 催化 | 用于表达野生型和Thr246突变体酶 |
| Bacillus stearothermophilus | 乳酸代谢 | BSLDH基因 | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 酶的天然来源 |
关键发现
野生型BSLDH对丙酮酸的kcat/KM为4.2×10^6 M^-1 s^-1，T246S为1.9×10^6 M^-1 s^-1，T246A和T246V均为1.1×10^5 M^-1 s^-1（较野生型降低约40倍），T246L的KM高达40 mM。T246A和T246V的NADH表观KM比野生型降低约20倍。单周转动力学显示野生型速率常数为235 s^-1，T246A为5.7 s^-1，T246A的氘动力学同位素效应为2.4，野生型为1.12。T246A和T246V对羟基丙酮酸的kcat分别是丙酮酸的5-8倍。
研究结论
Thr246的羟基对BSLDH催化至关重要，但不参与丙酮酸的生产性结合；其功能可能是通过稳定NADH烟酰胺环上的正电荷来促进氢化物从辅因子转移到底物。