An Effective Strategy for Exploring Unknown Metabolic Pathways by Genome Mining
- 作者
- Dorianne A. Castillo, Mariya D. Kolesnikova, Seiichi P. T. Matsuda
- 单位
- Department of Chemistry, Rice University; Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（2013）
- DOI
- 10.1021/ja401535g
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中大多数特化代谢通路未知，尤其是三萜类化合物的氧化修饰途径，传统方法难以从基因连接到产物，缺乏有效的解析策略。
研究策略
以拟南芥三个三萜产物（thalianol、arabidiol、marneral）为对象，通过基因簇分析和微阵列共表达选择候选P450，在酿酒酵母中与相应氧化角鲨烯环化酶及还原酶ATR2异源共表达，产生mg/L量级的代谢物；利用HSQC二维NMR对粗提物进行差异比较，识别并纯化新产物，结合GC-MS和经典NMR确定结构。
核心内容
该研究提出了一种将基因组挖掘、酵母异源表达和HSQC二维NMR谱图分析相结合的通用策略，用于探索植物中未知的三萜代谢通路。以拟南芥三种三萜产物thalianol、arabidiol和marneral为对象，通过基因簇分析和微阵列共表达筛选出候选P450酶，在酿酒酵母中与相应的氧化角鲨烯环化酶及还原酶ATR2共表达，利用HSQC在动态范围超过17000:1的粗提物中直接识别微量P450产物，无需繁琐纯化即可指导结构解析。研究鉴定出CYP708A2将thalianol氧化为7β-羟基thalianol和少量7α-羟基thalianol，早期比例约10:1；CYP705A1首次被发现催化arabidiol侧链裂解生成C19产物14-apo-arabidiol；CYP71A16则将marneral/marnerol选择性羟化于C23位。酵母培养物可产生毫克/升级的代谢物，细胞产量达1.5-2 g/100mL。该策略使拟南芥主要三萜合酶产物的代谢命运基本明确，为解析其他未知特化代谢通路提供了高效可行的方法。
创新点
1. 建立将基因组挖掘、异源表达和HSQC谱图分析相结合的通用策略；2. HSQC可在动态范围>10000:1的粗提物中分辨微量P450产物，无需纯化即可指导结构解析；3. 首次发现CYP705A1催化三萜侧链裂解生成C19产物（14-apo-arabidiol）；4. 精确鉴定了CYP708A2、CYP71A16的氧化产物（7β-羟基thalianol、23-羟基marneral等）。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | THAS1 (At5g48010) | Thalianol synthase | 催化 | OSC，将2,3-氧化鲨烯环化为thalianol |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | CYP708A2 (At5g48000) | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化thalianol的7β-羟基化，生成7β-羟基thalianol |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | ATR2 (At4g30210) | NADPH-cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 为P450提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | PEN1 (At4g15340) | Arabidiol synthase | 催化 | OSC，将2,3-氧化鲨烯环化为arabidiol |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | CYP705A1 (At4g15330) | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 催化arabidiol侧链C14-C15键裂解，生成C19产物14-apo-arabidiol |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | MRN1 (At5g42600) | Marneral synthase | 催化 | OSC，将2,3-氧化鲨烯环化为marneral |
| Saccharomyces cerevisiae JBY575 | 三萜生物合成 | CYP71A16 (At5g42590) | Cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 选择性催化marneral/marnerol的C23羟基化 |
关键发现
- 酵母培养物可产生mg/L量的植物代谢物
- HSQC在动态范围>17000:1下分辨出约100种酵母代谢物
- CYP708A2将thalianol氧化为7β-羟基thalianol（3）和少量7α-羟基thalianol（4），3:4比例早期约10:1，饱和时约2:1
- CYP705A1将arabidiol侧链裂解为C19甲基酮14-apo-arabidiol（10a），未皂化时只生成10a，皂化才产生10b
- CYP71A16选择性将marneral/marnerol的C23羟化生成23-羟基marneral/marnerol
- 酵母细胞产量为1.5-2 g/100mL。
研究结论
该研究成功展示了结合基因组挖掘、异源表达和HSQC分析探索未知代谢通路的能力，鉴定了三个拟南芥P450的功能及产物，使拟南芥主要三萜合酶产物的代谢命运基本清楚，为其他未知特化代谢通路的研究提供了有效方法。