Structure of the ent-Copaly1Diphosphate Synthase PtmT2 from Streptomyces platensis CB00739, a Bacterial Type II Diterpene Synthase
- 作者
- Jeffrey D. Rudolf, Liao-Bin Dong, Hongnan Cao, Catherine Hatzos-Skintges, Jerzy Osipiuk, Michael Endres, Chin-Yuan Chang, Ming Ma, Gyorgy Babnigg, Andrzej Joachimiak, George N. Phillips, Jr., Ben Shen
- 单位
- Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida 33458, United States; Department of Biosciences, Rice University, Houston, Texas 77005, United States; Midwest Center for Structural Genomics and Structural Biology Center, Biosciences Division, Argonne National Laboratory, Argonne, Illinois 60439, United States; Department of Molecular Therapeutics, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida 33458, United States; Natural Products Library Initiative, The Scripps Research Institute, Jupiter, Florida 33458, United States
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（2017）
- DOI
- 10.1021/jacs.6b04317
- 所属领域
- 结构生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
细菌来源的 type II 二萜合酶（DTS）缺乏结构表征，限制了对萜类合酶的结构进化与催化机制的理解。
研究策略
克隆表达 PtmT2，酶学表征确认其为 ent-CPP 合酶；通过 X-射线晶体学解析 PtmT2 结构；结合定点突变、分子对接和动力学分析研究关键残基与底物构象。
核心内容
该研究以来自 Streptomyces platensis CB00739 的 PtmT2 为对象，首次解析了细菌 type II 二萜合酶的晶体结构，填补了该类酶在结构进化中的空白。PtmT2 仅含 βγ 结构域，活性位点呈疏水空腔，催化 GGPP 环化生成 ent-CPP，动力学参数 kcat/Km 为 4.1 × 10⁴ s⁻¹ M⁻¹。晶体结构解析至 1.80 Å，并鉴定出潜在的 Mg²⁺ 结合基序 D128xxxxE。定点突变显示 K402A 完全失活而 K402R 恢复活性，D128A 和 E133A 使 kcat 降低约 30–40 倍且 Km 基本不变，D128E 比 D128A 活性提高 10 倍；高底物浓度下突变体出现底物抑制（Ki = 206–420 μM）。研究还通过模拟提出 GGPP 的催化活性构象，并表明 D313/H359 参与底物质子化。这些结果揭示了活性位点形状和理化性质对催化特异性的决定作用，提示细菌与植物 ent-CPP 合酶可能趋同进化，为理解细菌萜类合酶机制及发现新型二萜天然产物提供了结构基础。
创新点
首次报道细菌 type II 二萜合酶的晶体结构；鉴定了一个潜在的 Mg2+ 结合基序 D128xxxxE；通过模拟提出了 GGPP 的催化活性构象。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | Platensimycin/platencin 生物合成 | ptmT2 | PtmT2 | 催化 | 重组表达用于酶学、晶体学及突变分析；催化 GGPP 环化生成 ent-CPP。 |
| Streptomyces platensis CB00739 | Platensimycin/platencin 生物合成 | ptmT2 | PtmT2 | 催化 | 天然产生菌；PtmT2 是 ent-CPP 合酶，为 PTM/PTN 生物合成提供共同前体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Platensimycin/platencin 生物合成 | ptmT2 | PtmT2 K402A 突变体 | 催化 | 完全失去活性，表明 K402 对底物结合/催化至关重要。 |
关键发现
- PtmT2 晶体结构解析至
- 80 Å 分辨率；PtmT2 催化 GGPP 环化生成 ent-CPP，动力学参数 kcat =
- 8 ±
- 1 s-1, Km = 44 ± 5 μM, kcat/Km =
- 1 × 10^4 s-1 M-1；大尺度反应产率为
- 1 mg (41%)；定点突变表明 K402A 突变完全丧失活性，K402R 恢复活性；D128A 和 E133A 突变使 kcat 降低约 30-40 倍而 Km 基本不变；D128E 比 D128A 活性提高 10 倍；突变体在底物高浓度下出现底物抑制（Ki = 206-420 μM）。此外，结构显示 PtmT2 仅含 βγ 结构域，活性位点呈疏水空腔，D313/H359 参与底物质子化。
研究结论
PtmT2 作为首个细菌 type II 二萜合酶的结构，填补了萜类合酶结构进化中的空白。其活性位点形状和理化性质决定催化特异性，并提示细菌与植物 ent-CPP 合酶可能趋同进化。该研究为理解细菌萜类合酶机制及发现新型细菌二萜类天然产物奠定了基础。