Increased Acetate Ester Production of Polyploid Industrial Brewer's Yeast Strains via Precise and Seamless "Self-cloning" Integration Strategy
- 作者
- Jian Dong, Kun-Qiang Hong, Cui-Ying Zhang, Sheng-Sheng Dong, Xiao Li, Ye-Fu Chen, Dong-Guang Xiao
- 单位
- Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin, China
- 杂志
- Iranian Journal of Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.21859/ijb.1990
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业啤酒酵母为多倍体，难以进行常规遗传操作，且需要无外源DNA残留的安全改造方法来提高乙酸乙酯产量。
研究策略
采用两轮'自克隆'整合策略，将PGK1启动子精确无缝插入ATF1基因上游，通过URA3标记筛选及pop-out消除，实现所有ATF1等位基因过表达。
核心内容
针对多倍体工业啤酒酵母难以遗传操作且需避免外源DNA残留的问题，本研究开发了一种精确无缝的“自克隆”整合策略。通过两轮同源重组，将强启动子PGK1精确插入ATF1基因上游，并利用URA3标记筛选及pop-out消除实现无痕替换，单次转化即可完成所有ATF1等位基因的过表达。成功构建的菌株S6-P-12和S6-P-30中，ATF1 mRNA水平均为亲本S6的4倍，醇乙酰转移酶活性达3倍。在10°C发酵条件下，两菌株乙酸乙酯产量分别达23.98和24.00 mg/L，较亲本（19.91 mg/L）提高约20%，而异戊醇乙酸酯含量及生长发酵性能无显著差异。该工作为多倍体工业酵母提供了安全无标记的基因工程改造方法，有效提升了乙酸酯产量，对啤酒风味调控具有应用价值。
创新点
开发了适用于多倍体工业酵母的无外源DNA残留'自克隆'整合方法；通过单次转化即可完成多等位基因的启动子替换，避免loxP等痕迹。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 工业啤酒酵母S6 | 乙酸酯合成途径 | ATF1 | 醇乙酰转移酶I（AATase I） | 催化 | 过表达以增加乙酸乙酯合成 |
| 工业啤酒酵母S6 | 乙酸酯合成途径 | PGK1 | 磷酸甘油酸激酶启动子 | 调控 | 插入ATF1上游驱动过表达 |
关键发现
- 成功构建菌株S6-P-12和S6-P-30，其ATF1 mRNA水平均为亲本S6的4倍，AATase活性为3倍
- 在10°C发酵中，乙酸乙酯产量分别达23.98和24.00 mg/L，较S6（19.91 mg/L）提高20.44%和20.54%
- 异戊醇乙酸酯含量无显著差异
- 工程菌生长和发酵性能与亲本无明显区别。
研究结论
通过'自克隆'整合策略在工业啤酒酵母中过表达ATF1可有效提高乙酸乙酯产量，且无外源DNA残留，为多倍体工业酵母的基因工程改造提供了安全有效的方法。