Detection of active sorbitol-6-phosphate phosphatase in the haloacid dehalogenase-like hydrolase superfamily
- 作者
- Taejun Chin, Masahiko Ikeuchi
- 单位
- Department of Life Sciences, Graduate School of Arts and Sciences, The University of Tokyo; Core Research for Evolutional Science and Technology, Japan Science and Technology Agency
- 杂志
- Journal of General and Applied Microbiology（2017）
- DOI
- 10.2323/jgam.2017.12.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
山梨醇-6-磷酸磷酸酶（EC 3.1.3.50）催化山梨醇-6-磷酸生成山梨醇，但其编码基因尚未在任何生物中明确鉴定，限制了山梨醇代谢工程的优化。
研究策略
从大肠杆菌的卤酸脱卤酶样水解酶（HAD）超家族中选取6个候选蛋白及集胞藻PCC 6803的一个HAD样蛋白，进行克隆表达、纯化和酶学筛选，并测定动力学参数。
核心内容
该研究针对山梨醇-6-磷酸磷酸酶（EC 3.1.3.50）编码基因长期未明的瓶颈，从大肠杆菌卤酸脱卤酶样水解酶（HAD）超家族中选取六个候选蛋白及集胞藻PCC 6803的一个HAD样蛋白，通过克隆表达、纯化和酶学筛选鉴定其活性。结果显示HAD1（YniC）、HAD2（YfbT）、HAD12（YbiV）和HAD13（YidA）均具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，在0.25 mM底物下的比活力分别为6.1、9.3、2.9和2.0 μmol·min⁻¹·mg⁻¹，而HAD4、HAD6及Slr0953无活性。动力学分析表明，HAD2对山梨醇-6-磷酸的催化效率（kcat/Km=1.6×10⁴ s⁻¹·M⁻¹）高于其偏好底物葡萄糖-6-磷酸（7.1×10³ s⁻¹·M⁻¹），也优于酵母中最优候选酶YNL010W（2.7×10³ s⁻¹·M⁻¹）。这一发现首次鉴定了大肠杆菌中山梨醇-6-磷酸磷酸酶的功能基因，其中HAD1和HAD2可作为异源表达的首选酶，用于增强山梨醇-6-磷酸去磷酸化以优化微生物山梨醇生产，HAD2过表达还可能缓解重组蓝藻中山梨醇积累的毒性副作用，为山梨醇代谢工程提供了新的工具酶。
创新点
首次鉴定出大肠杆菌HAD1（YniC）、HAD2（YfbT）、HAD12（YbiV）和HAD13（YidA）具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，其中HAD2对山梨醇-6-磷酸的催化效率优于其先前报道的偏好底物葡萄糖-6-磷酸。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | yniC | HAD1 (YniC) | 催化 | 具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，kcat/Km=1.2×10⁴ s⁻¹·M⁻¹ |
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | yfbT | HAD2 (YfbT) | 催化 | 具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，kcat/Km=1.6×10⁴ s⁻¹·M⁻¹，高于其对葡萄糖-6-磷酸的活性 |
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | ybiV | HAD12 (YbiV) | 催化 | 具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，kcat/Km=5.3×10³ s⁻¹·M⁻¹ |
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | yidA | HAD13 (YidA) | 催化 | 具有山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性，kcat/Km=3.2×10³ s⁻¹·M⁻¹ |
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | yihX | HAD4 (YihX) | 催化 | 未检测到山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性 |
| Escherichia coli | 山梨醇生物合成 | yqAB | HAD6 (YqAB) | 催化 | 未检测到山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 蔗糖合成/山梨醇生物合成 | slr0953 | Slr0953 (SPP) | 催化 | 蔗糖-6-磷酸磷酸酶，未检测到山梨醇-6-磷酸磷酸酶活性 |
| Malus domestica (苹果) | 山梨醇生物合成 | s6pdh | NADP-山梨醇-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 催化葡萄糖-6-磷酸或果糖-6-磷酸生成山梨醇-6-磷酸 |
| 乳酸菌 | 山梨醇生物合成 | srlD2 | NAD-山梨醇-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 催化果糖-6-磷酸生成山梨醇-6-磷酸 |
关键发现
- 在0.25 mM山梨醇-6-磷酸下，HAD1、HAD2、HAD12、HAD13的活性分别为6.1、9.3、2.9、2.0 μmol·min⁻¹·mg⁻¹
- HAD4、HAD6和Slr0953无活性。动力学参数：HAD1（Km=1.8 mM，kcat=21 s⁻¹，kcat/Km=1.2×10⁴ s⁻¹·M⁻¹）、HAD2（Km=3.9 mM，kcat=63 s⁻¹，kcat/Km=1.6×10⁴ s⁻¹·M⁻¹）、HAD12（Km=2.3 mM，kcat=12 s⁻¹，kcat/Km=5.3×10³ s⁻¹·M⁻¹）、HAD13（Km=4.5 mM，kcat=14 s⁻¹，kcat/Km=3.2×10³ s⁻¹·M⁻¹）。HAD2对山梨醇-6-磷酸的kcat/Km高于其对葡萄糖-6-磷酸的7.1×10³ s⁻¹·M⁻¹。酵母HADs中最好的是YNL010W，kcat/Km仅2.7×10³ s⁻¹·M⁻¹。
研究结论
大肠杆菌HAD1和HAD2是目前最有希望用于异源表达以增强山梨醇-6-磷酸去磷酸化的候选酶，可用于代谢工程优化山梨醇生产；HAD2的过表达可能还有助于解毒重组蓝藻中山梨醇生产的副作用。