Point Mutations (Q19P and N23K) Increase the Operational Solubility of a 2α-O-Benzoyltransferase that Conveys Various Acyl Groups from CoA to a Taxane Acceptor
- 作者
- Irosha N. Nawarathne, Kevin D. Walker
- 单位
- Department of Chemistry and Department of Biochemistry & Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824
- 杂志
- Journal of Natural Products（2010）
- DOI
- 10.1021/np900524d
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型2-O-苯甲酰转移酶(TBT)在大肠杆菌中过量表达时大部分以无活性包涵体形式存在，可溶性酶量不足，阻碍了对其底物特异性的研究和应用。
研究策略
通过比对Taxus属TBT直系同源物序列，将野生型TBT的Q19和N23分别突变为脯氨酸(P)和赖氨酸(K)，得到突变体mTBT，显著提高其可溶性表达；进而用底物竞争实验和LC-ESIMS测定mTBT对多种酰基CoA的相对催化效率。
核心内容
针对紫杉醇合成途径中2α-O-苯甲酰转移酶（TBT）在大肠杆菌中过量表达时大量形成无活性包涵体、可溶性酶不足的问题，本研究通过比对红豆杉属TBT直系同源物序列，对野生型TBT进行了Q19P和N23K两个定点突变，获得突变体mTBT。结果表明，mTBT的可溶性表达量达到1 mg/L菌液，较野生型（200 μg/L）提高约5倍。利用底物竞争实验和LC-ESIMS系统表征了mTBT对19种酰基CoA的催化活性，发现其中18种非天然酰基CoA均可作为底物，且短链C4酰基CoA（丁酰CoA和丁烯酰CoA）的相对催化效率分别比天然底物苯甲酰CoA高12倍和19倍，杂环芳酰基和环己酰基等底物也能被有效接受。该双点突变策略有效解决了TBT可溶性表达不足的瓶颈，所获得的mTBT具有广谱酰基CoA底物适应性，为生物催化合成C-2位修饰的新型紫杉醇类似物提供了实用工具，同时为酰基转移酶底物谱扩展和代谢途径进化研究提供了新证据。
创新点
1. 通过两个定点突变(Q19P和N23K)使TBT可溶性表达提高约5倍；2. 首次系统表征了TBT对18种非天然酰基CoA底物的活性，发现短链C4酰基CoA(丁酰CoA和丁烯酰CoA)的催化效率分别比天然底物苯甲酰CoA高12倍和19倍；3. 证明mTBT可接受杂环芳酰基、环己酰基等多种底物，为生物催化合成2-O-酰基紫杉醇类似物提供工具。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源蛋白表达 | tbt (野生型及Q19P/N23K突变体) | TBT/mTBT | 催化 | 重组表达2-O-苯甲酰转移酶及其突变体，mTBT可溶性提高5倍 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | tbt | 野生型TBT | 催化 | 天然催化2-位苯甲酰化 |
| — | 紫杉醇生物合成 | dbat, tat, ndtbt, bppt | DBAT, TAT, NDTBT, BPPT等 | 催化 | 序列比对中涉及的其他Taxus酰基转移酶 |
| Taxus × media 和 Taxus wallichiana | 紫杉醇生物合成 | tbt同源基因 | TBT直系同源物 | 催化 | 用于指导突变设计的同源序列 |
关键发现
- mTBT的可溶性表达量为1 mg/L菌液，是野生型TBT(200 μg/L)的5倍
- mTBT可催化7,13-O,O-二乙酰-2-O-脱苯甲酰巴卡丁III与19种酰基CoA(含苯甲酰CoA)反应，其中18种非天然酰基CoA均有产物
- 相对kcat/KM值：苯甲酰CoA为1.8 min^-1 mM^-1，丁酰CoA为21 min^-1 mM^-1，丁烯酰CoA为35 min^-1 mM^-1，异丁酰CoA为2.9 min^-1 mM^-1，3-呋喃甲酰CoA为2.2 min^-1 mM^-1，2-噻吩甲酰CoA为2.9 min^-1 mM^-1，3-噻吩甲酰CoA为2.9 min^-1 mM^-1
- 苯甲酰CoA的KM=110 μM，kcat=0.19 min^-1
- 3-呋喃甲酰CoA的KM=6.4 μM，kcat=0.014 min^-1
- 4-甲基苯甲酰CoA的kcat/KM与苯甲酰CoA相同(1.8)
- 3-甲基苯甲酰CoA和环己酰CoA的产物生成速率分别比其它CoA硫酯慢约70倍和700倍。
研究结论
通过Q19P和N23K双点突变有效解决了TBT在大肠杆菌中可溶性表达不足的问题，获得的mTBT具有广泛的酰基CoA底物谱，可转移多种芳酰基和脂肪酰基到紫杉烷C-2位。该研究为利用生物催化合成C-2位修饰的新型紫杉醇类似物提供了基础，也支持代谢途径进化的“拼凑模型”假说。