CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of CiGAS and CiGAO to Reduce Bitterness in Chicory (Cichorium intybus L.)
- 作者
- Justine Domont, Margot Thiblet, Audrey Etienne, Harmony Alves Dos Santos, Thierry Cadalen, Philippe Hance, David Gagneul, Jean-Louis Hilbert, Caroline Rambaud
- 单位
- UMR Transfrontalière BioEcoAgro N° 1158, Univ. Lille, INRAE, Univ. Liège, UPJV, ISA, Univ. Artois, Univ. Littoral Côte d'Opale, Institut Charles Viollette, Joint Laboratory CHIC41H, University of Lille- Florimond Desprez, Cité scientifique, 59655 Villeneuve d'ascq, France
- 杂志
- Frontiers in Bioscience-Landmark（2023）
- DOI
- 10.31083/j.fbl2809201
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
菊苣根部倍半萜内酯（STLs）导致的苦涩味限制了菊苣粉在食品中的添加量（通常≤5%），需要创制低苦味菊苣品种以提升其功能性食品应用价值。
研究策略
利用CRISPR/Cas9技术分别靶向STL生物合成途径的前两个关键基因（CiGAS-short和CiGAO），通过发根农杆菌介导转化获得编辑株系；同时对13份田间菊苣进行感官评价，建立苦味评分与总STL含量的线性相关标尺，从而间接评估编辑株系的苦味。
核心内容
本研究利用CRISPR/Cas9技术靶向菊苣倍半萜内酯（STL）生物合成途径的前两个关键基因CiGAS-short和CiGAO，通过发根农杆菌介导转化获得编辑株系，旨在降低菊苣根部苦味。结果显示，CiGAS-short和CiGAO的突变频率分别为30.2%和20%，双等位突变株HR12（CiGAS-S1/S2）的总STL含量显著降低，理论苦味分数较对照下降86.35%；CiGAO双等位突变株HR18的总STL含量降低60.1%，苦味分数下降57.8%。对13份田间菊苣的感官评价建立了苦味评分与总STL含量的线性正相关标尺（Pearson r=0.68），用于间接评估编辑株系苦味。该研究首次将CRISPR/Cas9编辑菊苣与苦味感知间接关联，证明双等位敲除CiGAS-S1/S2或CiGAO可大幅降低STL含量与苦味，同时发现CiGAS-S5对STL合成贡献有限，且CiGAO突变仅部分降低STL，提示存在替代氧化酶。研究为通过分子标记辅助育种创制低苦味工业菊苣提供了理论与材料基础。
创新点
首次将CRISPR/Cas9编辑菊苣与苦味感知间接关联；证明双等位突变CiGAS-S1/S2或CiGAO能显著降低STL含量和理论苦味；发现CiGAS-S5对STL合成贡献不大，而CiGAO突变仅部分降低STL含量，提示存在替代氧化酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cichorium intybus L. (工业菊苣克隆ChicBitter002) | 倍半萜内酯(STL)生物合成途径 | CiGAS-short（拷贝S1、S2、S3、S5） | Germacrene A synthase (GAS) | 催化 | 催化FPP转化为germacrene A，是STL生物合成的第一个关键酶；CRISPR/Cas9靶向第三外显子，S4b因含逆转座子不表达而未靶向。 |
| Cichorium intybus L. (工业菊苣克隆ChicBitter002) | 倍半萜内酯(STL)生物合成途径 | CiGAO | Germacrene A oxidase (GAO) | 催化 | 细胞色素P450酶，催化germacrene A氧化为germacrene A酸；单拷贝基因，两个sgRNA靶向第一外显子。 |
| Cichorium intybus L. (工业菊苣克隆ChicBitter002) | 基因组编辑工具 | Cas9 (来自pYLCRISPR/Cas9P35s-B载体) | Cas9核酸酶 | 催化 | 在sgRNA引导下产生DNA双链断裂，用于敲除目标基因。 |
关键发现
- 突变频率：CiGAS-short为30.2%（13/43），CiGAO为20%（6/30）
- 基因敲除频率分别为11.6%和6.6%。双等位突变株HR12（CiGAS-S1/S2）和HR12*（另加CiGAS-S5）的总STL含量显著降低，理论苦味分数较Ctrl_HR下降86.35%±0.9%
- CiGAO双等位突变株HR18的总STL含量降低60.1%，理论苦味分数下降57.8%。感官分析显示13份田间菊苣中R09和R06最苦（苦味分7.83和6.13），R04和R13最不苦（2.21和2.49）
- 苦味与总STL含量呈正相关（Pearson r=0.68，R²=0.46，p=0.0103），其中9种STL与苦味相关，r范围0.5587-0.9223。
研究结论
采用CRISPR/Cas9同时敲除CiGAS-short的S1和S2拷贝或敲除CiGAO，并在双等位突变条件下可大幅降低菊苣根中STL含量与感知苦味，为通过分子标记辅助育种创制低苦味工业菊苣提供了理论与材料基础。