Cloning of two carotenoid ketolase genes from Nostoc punctiforme for the heterologous production of canthaxanthin and astaxanthin
- 作者
- Sabine Steiger, Gerhard Sandmann
- 单位
- Biosynthesis Group, Botanical Institute, Goethe University, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt, Germany
- 杂志
- Biotechnology Letters（2004）
- DOI
- 10.1023/b:bile.0000025880.91269.cf
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从 Nostoc punctiforme PCC 73102 克隆两个类胡萝卜素酮酶基因并评估其在异源宿主中合成角黄素（canthaxanthin）和虾青素（astaxanthin）的能力，特别是酮酶与羟化酶的高效协同问题。
研究策略
搜索基因组序列获得两个候选酮酶基因 crtW38 和 crtW148，克隆至表达载体 pQEQ32，分别转入产β-胡萝卜素和产玉米黄素的大肠杆菌转化体中进行功能互补分析，通过 HPLC 检测类胡萝卜素产物谱。
核心内容
该研究从念珠藻 Nostoc punctiforme PCC 73102 基因组中克隆了两个类胡萝卜素酮酶基因 crtW38 和 crtW148，并在大肠杆菌中异源表达，以评估其将β-胡萝卜素和玉米黄素转化为酮基化类胡萝卜素的能力。作者将两个基因分别转入积累β-胡萝卜素或玉米黄素的大肠杆菌菌株中，通过 HPLC 分析产物谱。结果显示，在产β-胡萝卜素菌株中，CrtW148 使角黄素占总类胡萝卜素的 81%，而 CrtW38 为 40%，两者海胆酮均约 4%。在产玉米黄素菌株中，CrtW38 不能合成虾青素，仅残留痕量海胆酮；而 CrtW148 高效合成虾青素，占 50%，并积累中间产物海胆酮 12%、角黄素 8% 及 3'-羟基海胆酮。该研究首次证实 CrtW148 是能高效转化玉米黄素为虾青素的酮酶，解决了以往酮酶对羟基化底物转化效率低的瓶颈，表明其与细菌 CrtZ 羟化酶协同良好，是异源合成虾青素的理想基因，具有重要工业应用前景。
创新点
发现 CrtW148 是首个被证实能高效转化玉米黄素（zeaxanthin）为虾青素的 β-胡萝卜素酮酶，突破了以往酮酶对羟基化底物转化效率极低的瓶颈；而 CrtW38 只能催化 β-胡萝卜素形成角黄素。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101/pACCAR16ΔcrtX | 类胡萝卜素生物合成（积累β-胡萝卜素） | crtW148 | CrtW148 | 催化 | 将β-胡萝卜素经海胆酮转化为角黄素，角黄素占总类胡萝卜素81% |
| Escherichia coli JM101/pACCAR25ΔcrtX | 类胡萝卜素生物合成（积累玉米黄素） | crtW148 | CrtW148 | 催化 | 将玉米黄素高效转化为虾青素，虾青素占50%，与CrtZ型羟化酶协同良好 |
| Escherichia coli JM101/pACCAR16ΔcrtX | 类胡萝卜素生物合成（积累β-胡萝卜素） | crtW38 | CrtW38 | 催化 | 将β-胡萝卜素转化为角黄素，角黄素占40%，海胆酮约4% |
| Escherichia coli JM101/pACCAR25ΔcrtX | 类胡萝卜素生物合成（积累玉米黄素） | crtW38 | CrtW38 | 催化 | 不能催化玉米黄素生成虾青素，仅产生痕量海胆酮 |
| Nostoc punctiforme PCC 73102 | 类胡萝卜素生物合成 | crtW38, crtW148 | CrtW38, CrtW148 | 催化 | 两个酮酶基因的来源菌株，氨基酸序列与已知CrtW型酮酶一致性33%-36% |
关键发现
- 在产β-胡萝卜素的大肠杆菌中，CrtW148 使角黄素占总类胡萝卜素的 81%，CrtW38 为 40%，两者海胆酮均约 4%。在产玉米黄素的大肠杆菌中，CrtW38 不能合成虾青素（玉米黄素占 85%，仅有痕量海胆酮）
- 而 CrtW148 高效合成虾青素占 50%，中间产物海胆酮 12%、角黄素 8%，另检测到 3'-羟基海胆酮。
研究结论
CrtW148 酮酶与细菌 CrtZ 型羟化酶表现出优异的协同作用，是适用于在产玉米黄素宿主中异源高效合成虾青素的理想基因，具有重要应用价值。