Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution
- 作者
- Harris H. Wang, Farren J. Isaacs, Peter A. Carr, Zachary Z. Sun, George Xu, Craig R. Forest, George M. Church
- 杂志
- Nature（2009）
- DOI
- 10.1038/nature08187
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
现有遗传工程方法仅限于对单个基因进行繁琐、串行的人为操作，无法并行和连续地定向进化基因网络或基因组，难以在实际时间尺度上产生新表型。
研究策略
开发多重自动化基因组工程（MAGE），利用λ-Red重组系统介导的单链DNA寡核苷酸等位替换，通过循环引入靶向多个染色体位点的寡核苷酸池，产生组合基因组多样性，并构建自动化设备实现快速连续操作，同时应用进化原理加速有益突变的积累。
研究路线图
核心内容
该研究开发了一种名为多重自动化基因组工程（MAGE）的技术，用以解决传统遗传工程只能对单个基因进行串行操作、难以在短时间内产生组合基因组多样性的问题。研究利用λ-Red重组系统介导的单链DNA寡核苷酸等位替换，构建自动化设备循环引入靶向多个染色体位点的寡核苷酸池，实现对大肠杆菌多达24个遗传位点的并行修饰，并将进化原理融入工程流程以加速有益突变积累。在优化条件下，每个2至2.5小时周期内等位替换效率超过30%，使用含6个连续简并碱基的寡核苷酸池经5轮操作后每个细胞平均产生3.1个碱基变化，相当于每天产生超过43亿个碱基对的变异，15轮后细胞群体覆盖全部4096种组合。将该技术应用于优化DXP生物合成途径时，同时修饰dxs、idi等24个基因，筛选后获得番茄红素产量提高超过5倍的菌株，最高约9000 μg/g细胞干重；其中dxs和idi组合优化使产量提高390%。这一工作表明MAGE能够快速生成基因组多样性并加速复杂表型优化，为代谢工程提供了高效自动化工具。
创新点
['首次实现多重、自动化的基因组工程', '可同时对24个遗传位点进行并行修饰', '每天产生超过43亿个组合基因组变异', '开发自动化设备实现连续循环操作', '将进化原理融入工程，加速新表型的产生']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli EcNR2 | 同源重组 | bet | λ-Red β蛋白 | 催化 | 介导单链DNA寡核苷酸与染色体靶标在复制叉处的退火，实现等位替换 |
| Escherichia coli EcHW2 | DXP生物合成途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 通过简并RBS序列优化翻译效率 |
| Escherichia coli EcHW2 | DXP生物合成途径 | dxr | DXP还原异构酶 | 催化 | RBS序列优化以提高表达 |
| Escherichia coli EcHW2 | DXP生物合成途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 单独优化使番茄红素产量提高40% |
| Escherichia coli EcHW2 | DXP生物合成途径 | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | RBS优化；与dxs组合优化比dxs+idi组合产量低27% |
| Escherichia coli EcHW2 | 应激响应/全局调控 | rpoS | RNA聚合酶σ因子（σS） | 调控 | 上调可增强对疏水性番茄红素积累的耐受，提高生长速率 |
| Escherichia coli EcHW2 | 糖酵解/磷酸甘油酸代谢 | ytjC | 磷酸甘油酸变位酶 | 催化 | 敲除以增加代谢通量 |
| Escherichia coli EcHW2 | 谷氨酸代谢 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 敲除增加番茄红素产量但导致生长率降低32% |
| Escherichia coli EcHW2 | 甲酸代谢 | fdhF | 甲酸脱氢酶 | 催化 | 敲除以减少副途径消耗 |
| Escherichia coli EcHW2 (pAC-LYC) | 番茄红素生物合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自pAC-LYC质粒，催化末端步骤 |
| Escherichia coli EcHW2 (pAC-LYC) | 番茄红素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自pAC-LYC质粒，催化末端步骤 |
| Escherichia coli EcHW2 (pAC-LYC) | 番茄红素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自pAC-LYC质粒，催化末端步骤 |
关键发现
- 在优化条件下，每个2-2.5小时周期内，单链DNA寡核苷酸介导的等位替换效率超过30%。使用含6个连续简并碱基的寡核苷酸池（cN6），5轮MAGE后每个细胞平均产生3.1个碱基变化，相当于每天产生超过4.3×10^9 bp的变异。15轮后细胞群体覆盖了所有4096种N6组合。在DXP途径优化中，同时修饰24个基因，每天产生约150亿个遗传变异（4.3×10^8 bp变化/周期×35周期）。筛选后获得番茄红素产量提高超过5倍的菌株，最高产量约9,000 p.p.m.（μg/g细胞干重），优于已有报道。单独优化idi使产量提高40%
- 同时优化dxs和idi使产量提高390%
- dxs+idi组合比dxs+ΔfdhF多产12%，比dxs+ispA多产27%。敲除gdhA在增加产量的同时使生长速率降低32%。
研究结论
MAGE是一种高效、廉价、自动化的多重基因组工程技术，能够快速生成组合基因组多样性，并通过加速进化优化复杂表型。该技术成功应用于大肠杆菌DXP途径的优化，显著提高番茄红素产量，展示了在代谢工程和合成生物学中的广泛应用潜力。