An alternative route to cyclic terpenes by reductive cyclization in iridoid biosynthesis
- 作者
- Fernando Geu-Flores, Nathaniel H. Sherden, Vincent Courdavault, Vincent Burlat, Weslee S. Glenn, Cen Wu, Ezekiel Nims, Yuehua Cui, Sarah E. O'Connor
- 杂志
- Nature（2012）
- DOI
- 10.1038/nature11692
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
环烯醚萜类化合物（iridoids）生物合成中关键的环化步骤由何种酶催化尚属未知，该酶催化10-氧代香叶醛生成环烯醚萜双环骨架，而所有已知萜烯环化酶均以香叶基二磷酸为底物并通过阳离子中间体进行，因此极可能存在一种全新的环化机制。
研究策略
利用长春花（Catharanthus roseus）转录组数据，以G10H为诱饵进行共表达分析筛选候选基因；在大肠杆菌中异源表达并纯化候选蛋白，通过TLC、GC-MS和NMR鉴定产物；利用病毒诱导基因沉默（VIGS）、RNA原位杂交和荧光蛋白定位进行体内验证；通过动力学测定、底物特异性分析和副产物结构解析探究反应机理。
核心内容
本研究从长春花转录组中筛选到一种全新的环烯醚萜合成酶iridoid synthase，解决了环烯醚萜类双环骨架生物合成中关键环化步骤的催化酶归属问题。该酶以10-氧代香叶醛为底物，依赖NAD(P)H进行还原性环化，与已知以香叶基二磷酸为底物、经阳离子中间体的萜烯环化酶截然不同。体外酶活实验显示其对10-氧代香叶醛的KM为4.5±0.2 μM，kcat为1.6±0.1 s⁻¹；病毒诱导基因沉默实验表明，该酶沉默后长春花叶片中vindoline和catharanthine含量显著下降，并积累多种与10-氧代香叶醛饲喂一致的中间产物，证实其体内功能。RNA原位杂交显示该酶与G10H共定位于内部韧皮部相关薄壁细胞，亚细胞定位显示其定位于细胞质并形成二聚体或更高阶结构。机理研究提出该酶先进行1,4-还原再经Diels-Alder或Michael加成环化的两步机制。此外，真菌还原酶EasA也能以10-氧代香叶醛为底物生成新的人工环状产物diquitadial（C10H16O2，HRMS m/z 168.1150），显示出利用无关还原酶人工合成环状萜类的潜力。该发现揭示了一种全新的环状萜烯生物合成途径，为环烯醚萜及单萜吲哚生物碱的异源重构和规模化生产提供了关键酶元件。
创新点
首次鉴定出iridoid synthase，一种利用NAD(P)H依赖的还原性环化酶，与已知萜烯环化酶完全不同；提出该酶先进行1,4-还原再通过Diels-Alder或Michael加成环化的两步机制；揭示短链脱氢酶/还原酶家族成员被招募为环化酶；证明无关的真菌还原酶EasA也能催化10-氧代香叶醛生成新的人工环状化合物diquitadial，为人工合成环状萜类提供了新思路。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | Iridoid biosynthesis | iridoid synthase | Iridoid synthase | 催化 | 异源表达并纯化，催化10-氧代香叶醛还原环化生成cis-trans-nepetalactol |
| Catharanthus roseus | Monoterpene indole alkaloid (MIA) biosynthesis | G10H | Geraniol 10-hydroxylase | 催化 | 用于共表达分析的上游酶，作为筛选iridoid synthase的诱饵；RNA原位杂交显示与iridoid synthase共定位于IPAP细胞 |
| Aspergillus fumigatus | Ergot alkaloid biosynthesis | easA | EasA | 催化 | 真菌还原酶，体外以10-氧代香叶醛为底物催化生成新的人工环状化合物diquitadial |
关键发现
- 鉴定出iridoid synthase，其以10-氧代香叶醛为底物，在NADH或NADPH存在下生成cis-trans-nepetalactol
- 动力学参数：对于10-氧代香叶醛，KM=4.5±0.2 μM，kcat=1.6±0.1 s⁻¹
- 对于NADPH，KM=4.7±0.7 μM，kcat=2.2±0.2 s⁻¹。VIGS沉默该酶后，长春花叶片中vindoline和catharanthine含量显著下降，并出现22种未鉴定化合物，其中10种与10-氧代香叶醛饲喂实验一致。RNA原位杂交显示该酶定位于内部韧皮部相关薄壁细胞（IPAP），与G10H共定位
- 亚细胞定位实验表明该酶形成二聚体或更高阶结构，定位于细胞质。底物特异性实验表明，该酶也能还原柠檬醛和6,7-二氢-10-氧代香叶醛，但不能环化(S)-10-氧代香叶醛。大型酶促反应分离出三个副产物：(S)-10-氧代香叶醛、10-氧代香叶醇和10-氧代芳樟醇。此外，真菌还原酶EasA以10-氧代香叶醛为底物时产生新型环戊烷化合物diquitadial（分子式C10H16O2，HRMS m/z 168.1150）。
研究结论
Iridoid synthase是环烯醚萜生物合成中催化双环骨架形成的关键酶，其通过NAD(P)H依赖的还原性环化机制发挥作用，与经典的阳离子型萜烯环化酶截然不同。该酶的发现不仅揭示了一种全新的环状萜烯生物合成途径，也为在植物和微生物中异源重构iridoid及单萜吲哚生物碱代谢途径、实现大规模生产奠定了基础。同时，无关还原酶也能催化人工环化反应，显示了产生更多结构多样产物的潜力。