高级醇 · 代谢工程文献库

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High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin

作者
C. J. Paddon, P. J. Westfall, D. J. Pitera, K. Benjamin, K. Fisher, D. McPhee, M. D. Leavell, A. Tai, A. Main, D. Eng, D. R. Polichuk, K. H. Teoh, D. W. Reed, T. Treynor, J. Lenihan, M. Fleck, S. Bajad, G. Dang, D. Dengrove, D. Diola, G. Dorin, K. W. Ellens, S. Fickes, J. Galazzo, S. P. Gaucher, T. Geistlinger, R. Henry, M. Hepp, T. Horning, T. Iqbal, H. Jiang, L. Kizer, B. Lieu, D. Melis, N. Moss, R. Regentin, S. Secrest, H. Tsuruta, R. Vazquez, L. F. Westblade, L. Xu, M. Yu, Y. Zhang, L. Zhao, J. Lievense, P. S. Covello, J. D. Keasling, K. K. Reiling, N. S. Renninger, J. D. Newman
杂志
Nature（2013）
DOI
10.1038/nature12051
所属领域
代谢工程 / 合成生物学
关键词
Saccharomyces cerevisiaeartemisinic acidartemisininmetabolic engineeringsemisynthesissynthetic biology
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解决的核心问题

青蒿素主要依赖植物提取，供应不稳定且价格波动，需要开发稳定、廉价的半合成生产途径以满足抗疟疾药物需求。

研究策略

利用合成生物学在酿酒酵母中重构完整的青蒿酸生物合成途径，包括发现并引入植物源的醇脱氢酶(ADH1)、醛脱氢酶(ALDH1)和细胞色素b5(CYB5)，并通过过程优化和萃取发酵提高产量，再通过化学方法将青蒿酸高效转化为青蒿素。

研究路线图

100%
核心问题：青蒿素依赖植物提取，供应不稳
策略：酿酒酵母重构青蒿酸途径＋化学转化
关键改造1：补全ADH1、ALDH1、CYB5氧化步骤
关键改造2：弱化CPR1、抑制ERG9与GAL80
关键改造3：IPM萃取发酵防止产物沉淀
关键改造4：化学转化新工艺（H2O2单线态氧）
结果：产量25 g/L，提升10倍；纯度99.6%
结论：半合成青蒿素工业化可行，稳定供应
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核心内容

该研究以酿酒酵母为底盘，通过合成生物学手段重构并优化了青蒿酸生物合成途径，旨在建立不依赖植物提取的半合成青蒿素生产路线。研究鉴定了黄花蒿来源的醇脱氢酶ADH1和醛脱氢酶ALDH1，补全了从紫穗槐二烯到青蒿酸的三步氧化途径，并通过下调CPR1表达、引入细胞色素b5（CYB5）等策略改善细胞活力。采用异丙基肉豆蔻酸酯进行原位萃取发酵以缓解产物抑制，最终菌株Y1284在补料分批工艺中青蒿酸产量达25 g/L，较初始菌株提升超过10倍。在此基础上，开发了使用过氧化氢产生单线态氧的化学转化工艺，将青蒿酸高效转化为青蒿素，总收率40–45%，所得产品纯度达99.6%。该工作实现了从微生物发酵到化学转化的完整半合成流程，为青蒿素的稳定工业化供应提供了可行方案，对降低抗疟疾药物成本具有实际意义。

创新点

1. 鉴定并表达了A. annua的ADH1和CYB5等酶，补全了从紫穗槐二烯到青蒿酸的三步氧化途径；2. 通过下调CPR1表达、表达CYB5以及引入ALDH1和ADH1，解决了细胞活力问题并大幅提高产量；3. 使用异丙基肉豆蔻酸酯(IPM)进行萃取发酵，避免了产物沉淀，使青蒿酸产量达到25 g/L；4. 开发了不需光化学设备的可规模化化学转化工艺，利用过氧化氢产生单线态氧，总产率40-45%。

研究对象（10）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 甲羟戊酸途径 tHMG1 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 催化 过表达以增强异戊二烯前体供应
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体合成 ADS 紫穗槐二烯合酶 催化 催化法呢基焦磷酸(FPP)生成紫穗槐二烯
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体氧化 CYP71AV1 紫穗槐二烯氧化酶（细胞色素P450） 催化 催化紫穗槐二烯氧化为青蒿醇
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体氧化 CPR1 细胞色素P450还原酶 催化 为CYP71AV1提供电子，通过弱启动子降低表达水平以改善细胞活力
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体氧化 CYB5 细胞色素b5 调控 增强CYP71AV1活性，提高青蒿酸产量并改善细胞生长
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体氧化 ADH1 青蒿醇脱氢酶 催化 催化青蒿醇氧化为青蒿醛
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 青蒿素前体氧化 ALDH1 青蒿醛脱氢酶 催化 催化青蒿醛氧化为青蒿酸
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 甾醇合成（竞争途径） ERG9 角鲨烯合酶 催化 通过CTR3或MET3启动子控制表达，利用铜或甲硫氨酸抑制以减少FPP分流至甾醇
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 氧化应激响应 CTT1 过氧化氢酶 催化 过表达以减少氧化应激，提高细胞活力
酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 半乳糖代谢调控 GAL80 Gal80p转录抑制因子 调控 敲除GAL80使GAL启动子驱动的基因组成型表达，无需诱导剂半乳糖

关键发现

  1. 最终菌株Y1284在乙醇脉冲补料工艺并添加IPM的条件下产青蒿酸25 g/L，较初始菌株Y285(3.3 g/L)提高超过10倍，碳摩尔产率提高7倍
  2. 表达ADH1使青蒿酸产量提高18%，在发酵罐中达8.1 g/L
  3. 早期诱导结合ALDH1表达产量提高至7.7 g/L
  4. ADH1对青蒿醇的Km=11±3 μM，kcat=41±5 s^-1
  5. 化学转化总收率40-45%，产品纯度99.6%（植物源样品为97.2-97.8%）
  6. IPM萃取发酵产物浓度>14 g/L，六倍于Y285的产量。

研究结论

成功构建了高产青蒿酸的酿酒酵母菌株并开发了高效的化学转化工艺，为半合成青蒿素的工业化生产提供了可行方案，有望稳定全球青蒿素供应并降低抗疟疾药物成本。