Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast
- 作者
- Florence Ménard Szczebara, Cathy Chandelier, Coralie Villeret, Amélie Masurel, Stéphane Bourot, Catherine Duport, Sophie Blanchard, Agnès Groisillier, Eric Testet, Patricia Costaglioli, Gilles Cauet, Eric Degryse, David Balbuena, Jacques Winter, Tilman Achtstetter, Roberto Spagnoli, Denis Pompon, Bruno Dumas
- 杂志
- Nature Biotechnology（2003）
- DOI
- 10.1038/nbt775
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从简单碳源出发，在微生物中实现氢化可的松的全生物合成，替代传统多步化学合成或半合成路线。
研究策略
通过引入13个工程基因，将酵母内源甾醇生物合成途径重定向，组装哺乳动物来源的完整生物合成途径（包括CYP11A1、ADX、ADR、CYP11B1、3β-HSD、CYP17A1、CYP21A1），并通过线粒体系统优化、破坏ATF2、GCY1和YPR1等副反应基因来提高产量。
核心内容
该研究在酿酒酵母中实现了从简单碳源葡萄糖出发的氢化可的松全生物合成，替代了传统多步化学合成路线。研究通过引入13个工程基因，将酵母内源甾醇途径重定向，组装了包含CYP11A1、ADX/ADR、CYP11B1、3β-HSD、CYP17A1和CYP21A1等哺乳动物来源的完整生物合成途径，并优化了线粒体电子传递系统。关键策略包括破坏ATF2、GCY1和YPR1等副反应基因以消除竞争性代谢流，同时过表达内源ARH1以增强电子供给。最终获得的最佳菌株可产生11.5±0.3 μg/ml氢化可的松，占总类固醇的70%；敲除ATF2使产量提高6-23倍，而同时敲除GCY1和YPR1后，17α-羟孕酮向11-脱氧皮质醇的转化率从18.7%提升至71.7%，ARH1过表达使氢化可的松占比从26%提高到60%。该工作证明复杂的哺乳动物膜结合P450途径可成功移植至微生物，为低成本、环境友好的工业激素生产奠定了基础。
创新点
首次在微生物中实现从简单碳源全合成氢化可的松；构建了由13个基因组成的人工自足途径；涉及多个膜结合P450酶和线粒体电子传递链的复杂系统；识别并消除了酵母内源副反应。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | CYP11A1 | CYP11A1 (P450侧链裂解酶) | 催化 | 催化胆固醇侧链裂解，产生孕烯醇酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | ADX | 肾上腺皮质铁氧还蛋白 (ADX) | 能量供给 | 电子传递载体，为CYP11A1和CYP11B1传递电子 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | ADR | 肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶 (ADR) | 能量供给 | NADPH依赖的还原酶，还原ADX |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | CYP11B1 | CYP11B1 (11β-类固醇羟化酶) | 催化 | 将11-脱氧皮质醇羟化为氢化可的松 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | 3β-HSD | 3β-羟类固醇脱氢酶/异构酶 | 催化 | 催化孕烯醇酮转化为孕酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | CYP17A1 | CYP17A1 (17α-类固醇羟化酶) | 催化 | 将孕酮羟化为17α-羟孕酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | CYP21A1 | CYP21A1 (21-类固醇羟化酶) | 催化 | 将17α-羟孕酮转化为11-脱氧皮质醇 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇生物合成途径 | Δ7-还原酶 (DWF5) | 植物Δ7-甾醇还原酶 | 催化 | 将酵母甾醇途径重定向产生肾上腺素能类似底物 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | ARH1 | 肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶同源物 (Arh1p) | 能量供给 | 酵母内源线粒体还原酶，可替代ADR为CYP11B1供电子，过表达可提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氢化可的松生物合成途径 | NCP1 | NADPH-P450还原酶 (Ncp1p) | 能量供给 | 为微粒体P450酶（如CYP17A1、CYP21A1）提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类固醇代谢副反应 | ATF2 | 醇O-乙酰转移酶 (Atf2p) | 催化 | 催化孕烯醇酮乙酰化形成孕烯醇酮乙酸酯，破坏该基因可提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类固醇代谢副反应 | GCY1 | 半乳糖诱导性醛酮还原酶 (Gcy1p) | 催化 | 具有20α-羟类固醇脱氢酶活性，催化17α-羟孕酮转化为17α,20α-二羟基孕烯醇酮 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类固醇代谢副反应 | YPR1 | 醛酮还原酶 (Ypr1p) | 催化 | 与Gcy1p协同催化17α-羟孕酮的20-酮还原 |
关键发现
- 最佳菌株UCYI可产生11.5±0.3 μg/ml氢化可的松，占总类固醇的70%
- 破坏ATF2使氢化可的松产量提高6-23倍
- 同时敲除GCY1和YPR1后，CYP21A1介导的17α-羟孕酮向11-脱氧皮质醇的生物转化率从18.7%提高到71.7%
- ARH1过表达使氢化可的松占总类固醇的比例从26%提高到60%。
研究结论
研究证明将复杂的哺乳动物生物合成途径（包括膜结合酶）成功转移到微生物是可行的，构建的工程酵母菌株能够以葡萄糖为碳源自足生产氢化可的松，为低成本、环境友好的工业激素合成奠定了基础。