Construction of lycopene-overproducing E. coli strains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets
- 作者
- Hal Alper, Kohei Miyaoku, Gregory Stephanopoulos
- 杂志
- Nature Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1038/nbt1083
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何高效识别影响重组菌株番茄红素积累表型的基因敲除靶点，并理解系统（模型）与组合（转座子）两类靶点之间的相互作用
研究策略
结合基于化学计量模型的系统性基因敲除预测和基于转座子文库的组合筛选，将两类靶点全部组合构建64株敲除菌株，通过摇瓶发酵和聚类分析绘制代谢图谱，并在优化条件下验证高产菌株
核心内容
该研究以大肠杆菌K12为底盘，在导入番茄红素合成途径（dxs、idi、ispFD及crtEBI）的基础上，系统性地将化学计量模型预测的8个敲除靶点与转座子文库筛选出的8个组合靶点逐一配对，构建了全部64株敲除菌株，通过摇瓶发酵和聚类分析绘制代谢图谱。结果显示，系统性靶点（如gdhA、aceE、fdhF）的敲除呈加性效应，主要通过增加前体和辅因子供给提升产量；而组合靶点（如rssB、yjfP、yjiD）呈非线性效应，多基因叠加反而使产量降至2000 ppm以下，最低仅500 ppm。经优化，获得两个全局最高产菌株，摇瓶产量约11000 ppm（µg/g DCW），分批补料摇瓶条件下达18000 ppm，500 ml生物反应器中达23000 ppm，较重组野生型提高8.5倍、较预工程亲本株提高2倍。该工作揭示了代谢靶点与调控靶点在表型贡献上的本质差异，提出调控靶点应置于后期使用的策略，为菌株优化的靶点组合逻辑提供了重要参考。
创新点
首次系统构建了8个化学计量靶点与8个组合靶点的全部组合（64株）并绘制代谢图谱；揭示了系统性靶点呈加性效应而组合靶点呈非线性且叠加有害；通过组合筛选获得全局最大产量菌株，实现8.5倍于野生型、2倍于亲本菌株的产量提升
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K12 | Lycopene biosynthetic pathway (MEP pathway) | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 染色体过表达（PT5启动子替换），提高异戊二烯前体供给 |
| Escherichia coli K12 | Lycopene biosynthetic pathway (MEP pathway) | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 染色体过表达，促进IPP/DMAPP异构化 |
| Escherichia coli K12 | Lycopene biosynthetic pathway (MEP pathway) | ispFD | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase (ispD) and 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (ispF) | 催化 | 染色体过表达（ispF和ispD操纵子），增强MEP途径通量 |
| Escherichia coli K12 | Lycopene biosynthetic pathway (crtEBI) | crtE, crtB, crtI | geranylgeranyl pyrophosphate synthase, phytoene synthase, phytoene desaturase | 催化 | 质粒pAC-LYC携带crtEBI操纵子，将IPP/DMAPP转化为番茄红素 |
| Escherichia coli K12 | Central metabolism (precursor supply) | gdhA | glutamate dehydrogenase | 催化 | 系统敲除靶点，增加α-酮戊二酸/谷氨酸代谢通量，提高前体供给 |
| Escherichia coli K12 | Central metabolism (precursor supply) | aceE | pyruvate dehydrogenase E1 component | 催化 | 系统敲除靶点，减少乙酰辅酶A分流，增加丙酮酸供给 |
| Escherichia coli K12 | Central metabolism (precursor supply) | fdhF | formate dehydrogenase H | 催化 | 系统敲除靶点，调节NADH/甲酸代谢，影响辅因子平衡 |
| Escherichia coli K12 | Central metabolism (precursor supply) | ytjC (gpmB) | phosphoglycerate mutase 2 | 催化 | 系统敲除靶点，改变糖酵解通量以增加前体供给 |
| Escherichia coli K12 | Global regulatory network (σS degradation) | rssB | response regulator RssB (Hnr) | 调控 | 组合敲除靶点，负责募集蛋白酶降解σS因子，影响应激响应和类胡萝卜素积累 |
| Escherichia coli K12 | Uncharacterized (putative hydrolase) | yjfP | putative hydrolase YjfP (249 aa) | 催化 | 组合敲除靶点，功能未知，推定为水解酶，通过未知动力学或调控机制影响番茄红素产量 |
| Escherichia coli K12 | Unknown function (regulatory effect) | yjiD | hypothetical protein YjiD (130 aa) | 调控 | 组合敲除靶点（启动子区插入突变Δp yjiD），功能未知，可能影响基因表达调控 |
关键发现
- 获得两个全局最大产量菌株，摇瓶产量约11000 ppm（µg/g DCW）
- 在优化分批补料摇瓶条件下产量可达18000 ppm（18 mg/g DCW）
- 在500 ml生物反应器中产量可达23000 ppm
- 全局最大产量菌株比重组野生型K12提高8.5倍，比预工程亲本株提高2倍
- 组合靶点多基因叠加（如rssB、yjfP、yjiD双敲除或三敲除）导致产量下降至2000 ppm以下，最低仅500 ppm
- 系统靶点（如gdhA、aceE、fdhF）组合呈加性效应，而组合靶点与系统靶点组合时破坏加性逻辑，产生分叉聚类
研究结论
系统性（化学计量）基因敲除靶点通过增加前体和辅因子供给来提升番茄红素产量，组合（转座子）靶点主要通过未知的动力学或调控机制起作用；代谢基因对表型的影响接近线性，而调控靶点的影响呈非线性且组合后可能有害；在菌株优化过程中应将全局调控靶点放在后期使用，以避免获得不兼容的表型；通过系统与组合方法穷举组合可有效鉴定最优菌株。