Genome mining of cyclodipeptide synthases unravels unusual tRNA-dependent diketopiperazine-terpene biosynthetic machinery
- 作者
- Tingting Yao, Jing Liu, Zengzhi Liu, Tong Li, Huayue Li, Qian Che, Tianjiao Zhu, Dehai Li, Qianqun Gu, Wenli Li
- 杂志
- Nature Communications（2018）
- DOI
- 10.1038/s41467-018-06411-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
环二肽合成酶（CDPS）途径尚未充分开发，其产物经萜烯修饰形成复杂二酮哌嗪-萜烯化合物的生物合成机制尚不清楚
研究策略
通过基因组挖掘和比较基因组分析发现三个CDPS基因簇（dmt1-3），结合异源表达、基因失活、定点突变、体外生化实验等手段阐明其生物合成途径
核心内容
该研究通过基因组挖掘与比较分析，从多种链霉菌中鉴定了三个环二肽合成酶基因簇（dmt1–3），并系统阐明了其介导的二酮哌嗪-萜烯化合物的生物合成机制。研究采用异源表达、基因失活、定点突变及体外生化实验，发现新CDPS酶DmtB1能以五种底物混杂合成cyclo(L-Trp-L-Xaa)系列产物，其中主产物为cWV。通过关键位点突变，L185F使cWA和cWP产量分别提高约2.4倍和3.1倍，而V205M使cWL增加约2.3倍；突变体L185F和V205M的cWV体外形成能力分别下降约43倍和6倍。此外，鉴定出DmtC1为PSL家族异戊烯基转移酶，可将法尼基焦磷酸连接至二酮哌嗪骨架，而DmtA1为膜结合萜烯环化酶，其关键残基突变（如E60A、D94A）导致环化活性丧失或显著降低，体内积累中间体。该工作揭示了CDPS依赖的DKP-萜烯全新组装途径，扩展了对CDPS催化多样性的认识，为通过组合生物合成生产多样化DKP衍生物提供了新酶学基础与改造靶点。
创新点
发现了新的CDPS DmtB1，能合成cyclo(L-Trp-L-Xaa)五种底物混杂产物；鉴定出DmtC1为PSL家族异戊烯基转移酶，DmtA1为膜结合萜烯环化酶；揭示CDPS依赖的DKP-萜烯组装机制
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 环二肽生物合成 | dmtB1 | DmtB1 | 催化 | CDPS，合成cyclo(L-Trp-L-Xaa)，主产物cWV |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 环二肽生物合成 | dmtB2 | DmtB2 | 催化 | CDPS，合成cWP和少量cWL |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 环二肽生物合成 | dmtB3 | DmtB3 | 催化 | CDPS，只合成cWL |
| Streptomyces coelicolor M1146 | DKP-萜烯生物合成 | dmtC1 | DmtC1 | 催化 | phytoene-synthase-like家族异戊烯基转移酶，将FPP连接到DKP的C-3位 |
| Streptomyces coelicolor M1146 | DKP-萜烯生物合成 | dmtA1 | DmtA1 | 催化 | 膜结合萜烯环化酶，催化pre-DMT环化生成DMT G |
| Streptomyces yousoufensis OUC6819 | DKP-萜烯生物合成 | dmtA1, dmtB1, dmtC1 | DmtA1, DmtB1, DmtC1 | 催化 | 天然宿主，负责dimentine G (9)和DMT F (12)的生物合成 |
| Streptomyces sp. NRRL F-5123 | DKP-萜烯生物合成 | dmtA2, dmtB2, dmtC2 | DmtA2, DmtB2, DmtC2 | 催化 | 合成DMT C (10)和DMT A (11) |
| Streptomyces aidingensis CGMCC 4.5739 | DKP-萜烯生物合成 | dmtA3, dmtB3, dmtC3 | DmtA3, DmtB3, DmtC3 | 催化 | 仅产生少量pre-DMT A (8)，引入dmtA3后无产物 |
关键发现
- DmtB1合成cyclo(L-Trp-L-Xaa)（Xaa=Val, Pro, Leu, Ile, Ala），主产物为cWV
- 突变L185F使cWA和cWP产量分别提高约2.4倍和3.1倍，cWV下降约10倍
- V205M使cWL产量增加约2.3倍
- 体外实验显示L185F和V205M使cWV形成能力分别下降约43倍和6倍
- M65V使cWP增加约1.7倍、cWV和cWI各下降约2倍
- DmtC1能将FPP连接到2-5生成pre-DMTs（6-8,13）
- DmtA1是环化酶，E60A和E60Q完全丧失互补活性，D214A仅产生极少DMT G，D94A不能互补，E133A活性降低
- ΔdmtA1突变株积累中间体6-8和13
研究结论
本研究揭示了CDPS依赖的DKP-萜烯生物合成新途径，包括CDPS合成DKP、PSL型异戊烯基转移酶催化法尼基化、膜萜烯环化酶催化环化，扩展了对CDPS及其依赖生物合成机制的理解，为组合生物合成生产多样化DKP衍生物奠定了基础