Triptyegium wilfordii cytochrome P450s catalyze the methyl shift and epoxidations in the biosynthesis of triptonide
- 作者
- Nikolaj Lervad Hansen, Louise Kjaerulff, Quinn Kalby Heck, Victor Forman, Dan Staerk, Birger Lindberg Møller, Johan Andersen-Ranberg
- 杂志
- Nature Communications（2022）
- DOI
- 10.1038/s41467-022-32667-5
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
雷公藤内酯酮（triptonide）等三环氧二萜具有重要生物活性，但植物来源的提取纯化成本高，且其生物合成途径中的关键酶（尤其是催化A环18(4→3)甲基迁移和B/C环环氧化的细胞色素P450）未知，阻碍了在酿酒酵母中建立异源发酵生产平台。
研究策略
基于T. wilfordii转录组文库筛选68个候选TwCYP基因，在N. benthamiana瞬时表达和S. cerevisiae基因组工程两套异源体系中进行功能表征；结合GC-MS、LC-qTOF-MS和NMR代谢产物鉴定，筛选出催化A环甲基迁移与内酯形成、B/C环环氧化的CYP；通过共表达细胞色素b5和额外基因拷贝优化产量，并采用补料分批发酵验证生产可行性。
研究路线图
核心内容
该研究通过功能基因组学策略，从雷公藤转录组中筛选68个候选细胞色素P450基因，在本氏烟瞬时表达和酿酒酵母基因组工程两套异源体系中进行系统功能表征，最终鉴定出四个关键P450酶——TwCYP82D274、TwCYP71BE86、TwCYP71BE85和TwCYP82D213，构成从miltiraidiene合成雷公藤内酯酮的最小基因集。研究首次发现CYP71BE亚家族P450催化植物二萜中前所未有的18(4→3)甲基迁移反应，并提出CYP催化的Wagner-Meerwein重排机制。共表达细胞色素b5（Twcytb5-A）使酵母中雷公藤内酯酮产量提高超过9倍，额外整合一份四基因拷贝后96孔板培养产量从0.081 mg/L翻倍至0.20 mg/L；1升补料分批发酵中雷公藤内酯酮最高达3.79 mg/L，并分离经NMR鉴定出18个二萜化合物（含13个新化合物）。该工作不仅揭示了雷公藤内酯酮生物合成中关键的甲基迁移和环氧化步骤，也为利用微生物发酵法生产这类高价值三环氧二萜化合物建立了概念验证平台。
创新点
首次发现CYP71BE亚家族P450催化植物二萜中前所未有的18(4→3) abeo-abietane甲基迁移；仅需4个TwCYP基因即可在异源宿主中实现triptonide全合成；发现并验证Twcytb5-A可使triptonide产量提高超过9倍；分离并经NMR解析了18个二萜化合物（含13个新化合物）；提出了CYP催化的Wagner-Meerwein重排机制。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | triptonide biosynthesis | TwCYP82D274 | TwCYP82D274 | 催化 | 催化miltiraidiene(3)的C环氧化生成14-羟基-dehydroabietadiene(5)等含氧二萜 |
| Nicotiana benthamiana / Saccharomyces cerevisiae | triptonide biosynthesis | TwCYP71BE86 | TwCYP71BE86 | 催化 | 催化A环18(4→3)甲基迁移及C18连续氧化，形成abeo-abietane骨架和中间体6、7 |
| Nicotiana benthamiana / Saccharomyces cerevisiae | triptonide biosynthesis | TwCYP71BE85 | TwCYP71BE85 | 催化 | 参与A环内酯环形成，与TwCYP71BE86协同产生triptophenolide(8) |
| Nicotiana benthamiana / Saccharomyces cerevisiae | triptonide biosynthesis | TwCYP82D213 | TwCYP82D213 | 催化 | 催化B/C环环氧化反应，完成triptonide(2)的最终合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | triptonide biosynthesis | Twcytb5-A | Twcytb5-A | 能量供给 | 细胞色素b5，作为CYP催化循环的电子供体，使triptonide产量提高超过9倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | triptonide biosynthesis | TwPOR1 | TwPOR1 | 能量供给 | NADPH-细胞色素P450还原酶，为TwCYP提供还原当量 |
| Nicotiana benthamiana / Saccharomyces cerevisiae | miltiraidiene biosynthesis | CfTPS1/CfTPS3 | CfTPS1/CfTPS3 | 催化 | 来自Coleus forskohlii的二萜合酶，催化GGPP生成miltiraidiene(3) |
关键发现
- T. wilfordii的4个CYP基因TwCYP82D274、TwCYP71BE86、TwCYP71BE85和TwCYP82D213构成从miltiraidiene合成triptonide的最小CYP基因集。TwCYP71BE86催化A环18(4→3)甲基迁移并参与C18氧化，TwCYP71BE85负责内酯环形成，TwCYP82D274和TwCYP82D213催化B/C环环氧化。共表达Twcytb5-A使S. cerevisiae中triptonide产量提高超过9倍。在96孔板0.5 mL培养中，基础菌株产量为0.081 mg/L（n=3，SD=0.004），额外整合一份4个TwCYP基因后产量翻倍至0.20 mg/L（n=3，SD=0.06）
- 1 L补料分批发酵中triptophenolide(8)第3天达最大值2.4 mg/L，triptonide(2)第7天达3.79 mg/L。从工程菌中共鉴定出23个GGPP来源二萜化合物，其中18个经NMR完成结构鉴定（13个为新化合物，5个为已知化合物）。
研究结论
TwCYP82D274、TwCYP71BE86、TwCYP71BE85和TwCYP82D213是在异源宿主中由miltiraidiene合成triptonide所必需的四个P450酶，其中CYP71BE亚家族催化独特的18(4→3)甲基迁移。Twcytb5-A作为电子供体可显著提高酵母体系中的产物积累。通过菌株工程和补料分批发酵获得3.79 mg/L triptonide，为雷公藤三环氧二萜的发酵法生产建立了概念验证平台。