Discovery of FoTO1 and Taxol genes enables biosynthesis of baccatin III
- 作者
- Conor James McClune, Jack Chun-Ting Liu, Chloe Wick, Ricardo De La Peña, Bernd Markus Lange, Polly M. Fordyce, Elizabeth S. Sattely
- 杂志
- Nature（2025）
- DOI
- 10.1038/s41586-025-09090-z
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇（Taxol）生物合成途径尚未完全解析，特别是工业前体baccatin III无法高效异源生产，且第一步氧化酶T5αH在异源体系中效率低、产生大量副产物，长期阻碍途径重构。
研究策略
开发并应用mpXsn（多重扰动×单核RNA测序）策略，通过同时测试272种扰动样本、结合单核转录组分析，提高共表达分析分辨率，鉴定紫杉醇生物合成基因的3个共表达模块，从中发现新基因并重构异源生物合成途径。
核心内容
该研究开发了mpXsn（多重扰动×单核RNA测序）策略，利用272个扰动样本和17,143个单核转录组解析紫杉醇生物合成基因的共表达网络，成功鉴定出三个共表达模块及8个此前未知的紫杉醇合成新基因。关键发现包括NTF2-like蛋白FoTO1，它通过蛋白-蛋白相互作用显著改善第一步氧化酶T5αH的产物选择性，将副产物转化为主产物taxadien-5α-ol，使早期途径产量提高10至17倍；此外还鉴定了CYP750C家族的C-9α羟化酶、C-7β酰基转移酶T7AT、两个2-ODD型T1βH及脱乙酰酶等。研究最终在本氏烟草中重构了17基因和20基因的完整途径，实现baccatin III从头合成，产量达到10至30 μg/g干重（分离产量约8.7 μg/g），与天然红豆杉针叶丰度相当，并成功合成3'-N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇。这项工作不仅攻克了紫杉醇异源生产中第一步氧化的长期瓶颈，其mpXsn方法也为非模式植物复杂代谢途径的解析提供了通用策略。
创新点
1. 首创mpXsn方法，将单核转录组与多重扰动结合，适用于无遗传操作工具的非模式植物；2. 发现8个紫杉醇生物合成新基因，包括FoTO1、CYP750C家族T9aH、T7AT、两个2-ODD型T1βH、两个脱乙酰酶及功能性PCL；3. 揭示FoTO1作为NTF2-like蛋白通过蛋白-蛋白相互作用改善T5αH第一步氧化产物选择性，解决长期瓶颈；4. 发现C-9α羟基化酶在CYP750C和CYP725A家族中的独立进化及底物特异性差异；5. 在本氏烟草中实现17-基因和20-基因途径，从头合成baccatin III和3'-N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | TDS | taxadiene synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成taxadiene(1)，存在TDS1和TDS2两个旁系同源 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T5αH | taxadiene 5α-hydroxylase | 催化 | 催化taxadiene C-5α羟基化，无FoTO1时主要产生OCT等副产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | FoTO1 | NTF2-like蛋白 | 调控 | 与T5αH和TDS2互作，促进第一步氧化正确产物生成，抑制副产物；C-端α螺旋关键 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | TAT | taxadien-5α-ol O-乙酰转移酶 | 催化 | 兼有C-5α和C-9α乙酰转移酶活性 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T10βH | taxane 10β-hydroxylase | 催化 | 催化C-10β羟基化 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | DBAT | 10-deacetylbaccatin III-10-O-乙酰转移酶 | 催化 | 催化C-10乙酰化 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T13αH | taxane 13α-hydroxylase | 催化 | 可补偿T5αH，同时催化5α和13α羟基化；FoTO1也调节其产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T9aH-750C | CYP750C家族P450 | 催化 | 催化C-9α羟基化，需要底物C-13α羟基；独立进化，与CYP725A不同 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T7AT | taxane C-7β-O-酰基转移酶 | 催化 | 催化C-7β酰化（乙酰/苯甲酰），是TOT发挥功能的前提 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T1βH-184 | 2-ODD双加氧酶 | 催化 | 催化C-1β羟基化，也可产生11(15-1)abeo-taxane副产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T1βH-686 | 2-ODD双加氧酶 | 催化 | T1βH-184同源（72%序列同一性），产生10-Bz水平更高，用于最终途径 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | TOT | taxane oxetanase | 催化 | 安装oxetane环；需要C-7β乙酰化底物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T9ox | taxane C-9 oxidase | 催化 | 2-ODD家族，氧化C-9为酮基 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T9dA | taxane 9α-O-deacetylase | 催化 | 去除C-9乙酰基，是T9ox作用前提；原编号DeAc898 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇生物合成 | T7dA | taxane 7β-O-deacetylase | 催化 | 去除C-7乙酰基；原编号DeAc1023 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇侧链生物合成 | PCL | β-苯丙氨酸-CoA连接酶 (AAE-867.5) | 催化 | 激活β-苯丙氨酸生成CoA硫酯，是侧链安装必需 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇侧链生物合成 | PAM | 苯丙氨酸氨基变位酶 | 催化 | 将L-苯丙氨酸异构化为β-苯丙氨酸 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 紫杉醇侧链生物合成 | BAPT | baccatin III:3-氨基-3-苯丙酰转移酶 | 催化 | 将β-苯丙酰基转移到baccatin III C-13羟基 |
关键发现
- 通过mpXsn分析17,143个单核转录组（272个样本），将已知紫杉醇基因划分为3个共表达模块，发现8个新基因。FoTO1使早期紫杉醇途径产量提高10-17倍，抑制T5αH副产物（OCT、iso-OCT等），使taxadien-5α-ol成为主要产物
- FoTO1与T5αH及TDS2的Kd值均为高纳摩尔范围，且C-端α螺旋对结合和功能至关重要。T9aH-750C（CYP750C）能催化生成4O3A中间体，而T9aH-725A不能
- T7AT的C-7β酰化是TOT发挥功能的前提
- T1βH-184和T1βH-686（2-ODD）催化C-1β羟基化，T1βH-686产生更高水平10-Bz。脱乙酰酶T9dA和T7dA依次去除C-9和C-7乙酰基，T9ox氧化C-9成酮，最终17-基因途径在本氏烟草叶片中baccatin III产量为10-30 μg/g干重（范围1.7-31.5 μg/g），与红豆杉针叶天然丰度相当，分离产量约8.7 μg/g干重。加入PCL（AAE-867.5）后成功从头合成3'-N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇。
研究结论
本研究鉴定并功能验证了紫杉醇生物合成途径的8个新基因，重构了从taxadiene到baccatin III（17基因）及3'-N-去苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇（20基因）的完整途径，在本氏烟草中实现了与天然红豆杉相当的baccatin III产量。FoTO1的发现解决了T5αH第一步氧化的长期瓶颈，表明蛋白质支架在植物次生代谢中具有重要作用。mpXsn策略为解析复杂基因组植物的未知代谢途径提供了高效、可推广的方法。