An orthogonalized PYR1-based CID module with reprogrammable ligand-binding specificity
- 作者
- Sang- Youl Park, Jingde Qiu, Shuang Wei, Francis C. Peterson, Jesús Beltrán, Angélica V. Medina- Cucurella, Aditya S. Vaidya, Zenan Xing, Brian F. Volkman, Dmitri A. Nusinow, Timothy A. Whitehead, Ian Wheeldon, Sean R. Cutler
- 杂志
- Nature Chemical Biology（2023）
- DOI
- 10.1038/s41589-023-01447-7
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
设计一个与内源ABA信号通路正交的PYR1/HAB1化学诱导二聚化模块，并实现配体结合特异性的可重编程，以支持多通道、多输入的基因电路构建。
研究策略
通过位点饱和突变筛选破坏互作的PYR1/HAB1突变体，再利用反向双杂交系统筛选互相抑制的突变组合，引入界面盐桥实现正交化；随后通过定向进化重塑配体结合口袋，获得对mandipropamid和azinphos-ethyl等配体高灵敏响应的变体；最后在酵母和拟南芥中验证多通路基因电路。
核心内容
该研究设计并构建了一个与内源ABA信号通路正交的PYR1/HAB1化学诱导二聚化模块，并通过可编程的配体结合特异性扩展其应用范围。研究者首先通过位点饱和突变筛选出236个PYR1和163个HAB1的破坏性突变，再借助反向双杂交系统鉴定出9对互抑组合，其中最优的PYR1 T162D/HAB1 Y393R突变对通过引入2.7 Å盐桥实现界面正交化；随后利用定向进化重塑配体结合口袋，获得对mandipropamid和azinphos-ethyl等配体高灵敏响应的变体。关键结果是，PYR1*AZIN在酵母中对azinphos-ethyl的EC50为52 nM，且对多种有机磷配体具有高选择性；在拟南芥中，100 nM azinphos-ethyl即可激活GFP报告基因，250 nM可诱导RUBY色素产生。该模块支持在酵母和拟南芥中构建双输入/输出基因电路，对ABA和mandi均呈纳摩尔灵敏度且交叉反应可忽略。这项工作为植物和微生物中的多通道生物传感器及合成基因电路提供了可编程、正交化的新工具。
创新点
构建了正交化的PYR1/HAB1二聚化模块（T162D/V393R盐桥界面）；实现了配体结合特异性的重编程，获得纳摩尔级灵敏度的PYR1*MANDI和PYR1*AZIN变体；在酵母和拟南芥中实现了双输入/输出基因电路，可检测禁用有机磷农药。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | ABA信号通路 | PYR1 | PYR1 | 调控 | ABA受体，作为化学诱导二聚化的配体感受器，结合配体后与HAB1结合 |
| Saccharomyces cerevisiae | ABA信号通路 | HAB1 | HAB1 | 催化 | 2C型蛋白磷酸酶，被配体激活的PYR1抑制，此处作为二聚化伴侣 |
| Saccharomyces cerevisiae | 化学诱导二聚化 | PYR1*MANDI | PYR1*MANDI | 调控 | 工程化PYR1变体，响应mandipropamid，携带正交化突变T162D及高灵敏突变 |
| Saccharomyces cerevisiae | 化学诱导二聚化 | PYR1*AZIN | PYR1*AZIN | 调控 | 工程化PYR1变体，响应azinphos-ethyl，在酵母中EC50为52 nM |
| Saccharomyces cerevisiae | 化学诱导二聚化 | PYR1*DIAZI | PYR1*DIAZI | 调控 | 响应diazinon的PYR1变体，用于酵母双电路构建 |
| Saccharomyces cerevisiae | 化学诱导二聚化 | HAB1* | HAB1* | 调控 | 正交化HAB1变体（R199A,D204A,S322D,V393R,R505A），催化活性失活，但与PYR1*变体特异结合 |
| Arabidopsis thaliana | ABA信号通路 | PYR1*DIAZI | PYR1*DIAZI | 调控 | 在植物中响应diazinon，激活内源ABA信号，导致气孔关闭和叶片温度升高 |
| Arabidopsis thaliana | 合成基因电路 | PYR1*AZIN | PYR1*AZIN | 调控 | 在植物中响应azinphos-ethyl，驱动下游报告基因表达 |
| Arabidopsis thaliana | 合成基因电路 | HAB1* | HAB1* | 调控 | 与PYR1*AZIN配对，激活转录，催化失活以避免内源ABA通路交叉 |
关键发现
- 通过筛选鉴定出236个PYR1和163个HAB1的破坏性突变，并确定了9对互抑组合，最佳为PYR1 T162D/HAB1 Y393R。X射线晶体结构显示T162D/V393R形成距离2.7Å的盐桥，复合物分辨率2.4Å。PYR1*MANDI/HAB1*模块在Y2H中对mandipropamid具有纳摩尔级响应，且不与野生型HAB1交叉。PYR1*AZIN在酵母中对azinphos-ethyl的EC50为52 nM，并对多种有机磷配体具有高选择性。在拟南芥中，PYR1*DIAZI表达使叶片在500 nM diazinon处理后温度升高
- 100 nM azinphos-ethyl可激活GFP报告基因，250 nM azinphos-ethyl诱导RUBY色素产生。双电路在酵母中对ABA和mandi具有纳摩尔灵敏度，交叉反应可忽略。
研究结论
成功开发了正交化的PYR1/HAB1化学诱导二聚化模块，其配体特异性可重编程，能够以纳摩尔灵敏度响应多种有机磷农药，并在酵母和拟南芥中构建多输入/输出基因电路，为植物和微生物生物传感器及合成生物学应用提供了新的可编程工具。