Uncoupled activation and cyclisation in catmint reductive terpenoid biosynthesis
- 作者
- Benjamin R Lichman, Mohamed O Kamileen, Gabriel R Titchiner, Gerhard Saalbach, Clare E M Stevenson, David M Lawson, Sarah E O'Connor
- 单位
- The John Innes Centre, Department of Biological Chemistry, Norwich Research Park, Norwich, UK
- 杂志
- Nature Chemical Biology（2018）
- DOI
- 10.1038/s41589-018-0185-2
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
揭示猫薄荷（Nepeta mussinii）中荆芥内酯不同立体异构体生物合成的分子机制，尤其是iridoid synthase（ISY）仅催化底物8-氧香叶醛的还原活化而不催化后续环化，环化步骤由独立的环化酶催化，从而解决还原与环化偶联的经典萜类合成范式之外的立体化学调控问题。
研究策略
通过酶学机制分析（缓冲液浓度/pH影响产物分布）、比较毛状体与叶片的蛋白组学鉴定毛状体富集的候选脱氢酶，继而进行体外级联反应验证NEPS的环化活性，并结合X射线晶体结构、同源建模和定点突变解析酶催化机理。
核心内容
该研究揭示了猫薄荷中荆芥内酯不同立体异构体生物合成的分子机制。通过酶学分析、蛋白组学、体外级联反应、X射线晶体学及定点突变等手段，作者发现荆芥内酯合成采用还原与环化解偶联的策略：环烯醚萜合酶ISY仅负责将底物8-氧香叶醛还原为反应性烯醇中间体，该中间体扩散至溶剂中，随后被独立的NEPS环化酶捕获并完成立体选择性环化，而非传统萜类合成中还原与环化紧密偶联。研究鉴定出NEPS1/2/3三个酶，其中NEPS3属于短链脱氢酶家族但主要催化非氧化还原的[4+2]环化，NAD+仅作为结构支架；其S154残基构成氧阴离子结合位点，S154L突变完全丧失cis-cis环化活性。NEPS1兼具环化酶与脱氢酶双重功能，其T154G突变使Km增加150倍并改变产物分布。该发现为环烯醚萜及单萜吲哚生物碱的代谢重构提供了关键酶元件，展示了植物次生代谢酶的结构可塑性与进化创新。
创新点
首次发现荆芥内酯生物合成中还原激活与环化解偶联，由ISY生成的反应性烯醇中间体扩散至溶剂中并被NEPS酶捕获；鉴定出三个NEPS酶（NEPS1/2/3），其中NEPS3结构上属于SDR但主要催化非氧化还原的[4+2]环化，NAD+仅作为结构支架而非辅底物；NEPS1兼具环化酶和脱氢酶双重功能，其T154G突变导致Km增加150倍并改变产物分布。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（异源表达宿主） | 荆芥内酯/环烯醚萜生物合成 | ISY (CrISY, NmISY2, AmISY) | Iridoid synthase（环烯醚萜合酶） | 催化 | 催化8-氧香叶醛还原为8-氧香叶醇烯醇中间体3，不催化后续环化 |
| 大肠杆菌（异源表达宿主） | 荆芥内酯/环烯醚萜生物合成 | NEPS1 (NmNEPS1, MG677124) | NEPS1（荆芥内酯醇相关短链脱氢酶/环化酶） | 催化 | 兼具环化酶和NAD+依赖脱氢酶活性，将3环化为cis-trans-荆芥内酯醇4a，并氧化4a/4b为相应荆芥内酯 |
| 大肠杆菌（异源表达宿主） | 荆芥内酯/环烯醚萜生物合成 | NEPS2 (NmNEPS2, MG677125) | NEPS2（短链脱氢酶/环化酶） | 催化 | 专一促进cis-trans-荆芥内酯醇4a形成，无脱氢活性 |
| 大肠杆菌（异源表达宿主） | 荆芥内酯/环烯醚萜生物合成 | NEPS3 (NmNEPS3, MG677126) | NEPS3（非氧化还原环化酶） | 催化 | 结构为SDR但主要催化非氧化还原[4+2]环化，生成cis-cis-荆芥内酯醇4b；NAD+仅作为结构稳定因子 |
| 体外酶反应体系 | 荆芥内酯/环烯醚萜生物合成 | 无（底物为S-8-氧香茅醛6） | 无 | 催化 | 高浓度缓冲液（0.5 M MOPS）促进6互变异构为活性烯醇3，模拟ISY产物并作为NEPS底物 |
关键发现
- ISY还原8-氧香叶醛生成8-氧香叶醇烯醇中间体3，但环化为非酶促过程，产物分布受缓冲液浓度影响：低浓度（<50 mM MOPS）主要生成cis-trans-荆芥内酯醇4a，中等浓度（50-500 mM）主要生成环烯醚醛5a，高浓度（≥500 mM）直接互变异构为6
- NEPS1可催化4a/4b氧化为相应荆芥内酯1a/1b，NEPS2促进4a生成，NEPS3专一生成cis-cis-荆芥内酯醇4b
- NEPS3在无NAD+补充时仍具环化活性，添加NAD+促进反应但不被消耗
- NEPS3晶体结构（PDB: 6F9Q）显示其活性位点缺乏SDR催化四联体的Ser/Thr（G152），S154构成氧阴离子结合位点，S154L突变使NEPS3完全丧失cis-cis环化活性并在10 μM时转为促进cis-trans-4a生成
- NEPS1 T154G突变导致对4a的Km升高150倍，削弱脱氢活性但增强环化活性
- NEPS基因登录号MG677124（NEPS1）、MG677125（NEPS2）、MG677126（NEPS3）。
研究结论
荆芥内酯生物合成采用解偶联的还原激活与环化策略：ISY催化还原产生反应性烯醇中间体，该中间体扩散至溶剂中被NEPS环化酶捕获并立体选择性环化。NEPS1/2为‘被动型’环化酶，主要通过保护中间体免于非特异性互变异构而促进顺式-反式产物；NEPS3为‘主动型’环化酶，利用S154等残基精确控制顺式-顺式立体化学。该发现为环烯醚萜和单萜吲哚生物碱的代谢重构提供了关键酶元件，并展示了植物次生代谢酶的结构可塑性与进化创新性。