Discovery of non-squalene triterpenes
- 作者
- Hui Tao, Lukas Lauterbach, Guangkai Bian, Rong Chen, Anwei Hou, Takahiro Mori, Shu Cheng, Ben Hu, Li Lu, Xin Mu, Min Li, Naruhiko Adachi, Masato Kawasaki, Toshio Moriya, Toshiya Senda, Xinghuan Wang, Zixin Deng, Ikuro Abe, Jeroen S. Dickschat, Tiangang Liu
- 杂志
- Nature（2022）
- DOI
- 10.1038/s41586-022-04773-3
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统观点认为所有三萜均由角鲨烯或氧化角鲨烯经三萜合酶生成，而短链萜烯则由聚异戊烯基二磷酸合成。本研究旨在发现并表征不依赖角鲨烯的三萜生物合成新途径。
研究策略
利用酵母底盘基因组挖掘平台筛选候选嵌合PT-TC酶，通过体外酶学表征、同位素标记实验、X射线晶体学和冷冻电镜结构分析揭示环化机制，并开发基于AlphaFold2的结构预测筛选平台进行新酶的基因组挖掘。
研究路线图
核心内容
本研究通过酵母底盘基因组挖掘平台，发现并表征了一类不依赖角鲨烯的新型嵌合I类三萜合酶，颠覆了长期以来认为三萜均由角鲨烯或氧化角鲨烯生成的传统观点。研究鉴定的TvTS、MpMS和CgCS三种酶均包含PT和TC两个结构域，其中PT结构域可将DMAPP和IPP合成六异戊烯基焦磷酸（HexPP），再由TC结构域将其环化为三萜产物。体外酶学表征与同位素标记实验揭示了C1-III-IV和C1-VI两种新颖环化模式；X射线晶体学和冷冻电镜结构分析分别解析了TvTS-TC与底物类似物复合物（分辨率为2.0 Å）及MpMS-PT（3.17 Å）的结构。MpMS产物macrophomene含22元大环，为迄今已知最大的萜类大环。从2升发酵中分离获得talaropentaene 7.2 mg和colleterpenol 30.5 mg。基于AlphaFold2的结构预测筛选平台从10个候选酶中成功发现CgCS，证实该策略可高效挖掘新酶。这些发现扩展了I类萜烯合酶的产物谱系，为萜烯生物合成多样性和新天然产物的开发提供了全新视角。
创新点
首次发现非角鲨烯依赖的三萜合酶（TvTS、MpMS和CgCS），它们利用DMAPP和IPP或六异戊烯基焦磷酸（HexPP）生成三萜；揭示了C1-III-IV和C1-VI两种环化模式；发现22元大环萜类；开发了基于AlphaFold2的高效筛选平台。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YZL141 | 三萜生物合成 | ZTR_06220 | Talaropentaene synthase (TvTS) | 催化 | 异源表达产生talaropentaene (1) |
| Saccharomyces cerevisiae YZL141 | 三萜生物合成 | MPH_02178 | Macrophomene synthase (MpMS) | 催化 | 异源表达产生macrophomene (2) |
| Saccharomyces cerevisiae YZL141 | 三萜生物合成 | Cgl13855 | Colleterpenol synthase (CgCS) | 催化 | 异源表达产生colleterpenol (3) |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成 | ZTR_06220-PT | TvTS-PT | 催化 | 催化DMAPP和IPP缩合生成HexPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成 | ZTR_06220-TC | TvTS-TC | 催化 | 环化HexPP生成talaropentaene (1) |
| Talaromyces verruculosus TS63-9 | 三萜生物合成 | ZTR_06220 | TvTS | 催化 | 天然宿主中受amyB启动子调控时产生talaropentaene (1) |
| Macrophomina phaseolina MS6 | 三萜生物合成 | MPH_02178 | MpMS | 催化 | 植物病原真菌来源的MpMS |
| Colletotrichum gloeosporioides ES026 | 三萜生物合成 | Cgl13855 | CgCS | 催化 | 内生真菌来源的CgCS |
关键发现
- TvTS与MpMS分别与PaFS和AcOS具有40.4%和33.4%的氨基酸序列同一性。TvTS和MpMS的PT结构域可分别将DMAPP和IPP转化为HexPP，TC结构域再将HexPP环化为talaropentaene (1) 和macrophomene (2)。MpMS产物macrophomene含22元环，是迄今已知最大的萜类大环。从2升发酵中分离得到化合物1
- 2 mg和化合物3
- 5 mg。TvTS突变体A212M和Y216W分别保留15%和28%的活性，G300M完全失活。TvTS-TC的apo和浸泡2,3-二氢-HexPP的晶体结构分辨率分别为2.4 Å和2.0 Å；MpMS-PT的cryo-EM结构分辨率为3.17 Å，交联MpMS为4.00 Å。MpMS形成六聚体，而PaFS形成八聚体和六聚体比例9:1。通过AlphaFold2筛选，从10个候选酶中发现CgCS产生colleterpenol (3)。
研究结论
本研究鉴定了一类新的嵌合I类三萜合酶，它们通过HexPP非角鲨烯依赖地合成三萜，扩展了I类萜烯合酶的产物范围，为理解自然界萜烯生物合成提供了新视角。