HMG-CoA reductase from Camphor Tulsi (Ocimum kilimandscharicum) regulated MVA dependent biosynthesis of diverse terpenoids in homologous and heterologous plant systems
- 作者
- Shilpi Bansal, Lokesh Kumar Narnoliya, Bhawana Mishra, Muktesh Chandra, Ritesh Kumar Yadav, Neelam Singh Sangwan
- 单位
- CSIR-Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow; Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)
- 杂志
- Scientific Reports（2017）
- DOI
- 10.1038/s41598-017-17153-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征樟脑罗勒（Ocimum kilimandscharicum）中MVA途径关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），阐明其在萜类生物合成中的调控作用，并评估其作为代谢工程工具增强同源和异源植物中萜类代谢物积累的潜力。
研究策略
从樟脑罗勒中克隆OkHMR基因，进行序列分析和原核表达及酶动力学表征；通过瞬时过表达于同源（Ocimum种）和异源（Withania somnifera、Artemisia annua）植物，并结合他汀类抑制剂处理，从正反两个方面验证OkHMR对MVA途径萜类合成的调控功能。
研究路线图
核心内容
该研究从樟脑罗勒中克隆并表征了MVA途径关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因OkHMR。序列分析表明其开放阅读框长1698 bp，编码565个氨基酸，与丹参HMGR同源性最高达94%。酶动力学测定显示该酶对HMG-CoA的Km为0.088 mM，对NADPH的Km为0.903 mM。组织表达分析发现花中表达量最高，盐胁迫可使其表达量增加4–24倍。通过在同源和异源植物中瞬时过表达OkHMR，发现其能显著提升多种萜类代谢物的积累：在Ocimum sanctum中β-榄香烯增加7.4%、石竹烯增加37.87%；在青蒿中总精油含量达0.64 mg/g，青蒿素含量提升7.4%；在睡茄中总醉茄内酯含量增加44%。相反，他汀类抑制剂处理使萜类含量明显下降，从正反两方面证实了OkHMR对MVA途径的调控作用。该研究表明OkHMR是萜类生物合成的关键调控酶，可作为代谢工程工具用于提高药用和芳香植物中萜类活性成分含量。
创新点
首次从Ocimum属中克隆并表征HMGR基因；首次在O. kilimandscharicum中实现基因转化；证明了OkHMR可作为代谢工程工具促进药用植物中萜类代谢物的合成。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 用于重组蛋白的异源表达和酶动力学表征 |
| Ocimum kilimandscharicum | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 同源瞬时过表达，提高精油和倍半萜含量 |
| Ocimum sanctum | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 异源瞬时过表达，增加β-榄香烯、石竹烯和germacrene D等 |
| Ocimum basilicum | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 异源瞬时过表达，增加柠檬烯等单萜含量 |
| Ocimum gratissimum | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 异源瞬时过表达，增加β-罗勒烯、germacrene A等 |
| Withania somnifera | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 异源瞬时过表达，增加醉茄内酯和甾醇含量 |
| Artemisia annua | MVA途径（萜类生物合成） | OkHMR | OkHMR (HMGR) | 催化 | 异源瞬时过表达，增加青蒿素和精油含量 |
关键发现
- OkHMR全长ORF为1698 bp，编码565个氨基酸，蛋白分子量60.53 kDa
- 与丹参HMGR同源性最高（94%）。酶动力学显示对HMG-CoA的Km为0.088 mM、Vmax为0.909 μmol/min/mg、kcat为31.13 s⁻¹、kcat/Km为3.53×10⁵ M⁻¹s⁻¹
- 对NADPH的Km为0.903 mM、Vmax为0.425 μmol/min/mg、kcat为14.53 s⁻¹、kcat/Km为1.6×10⁴ M⁻¹s⁻¹。组织表达分析表明花中表达最高
- 盐胁迫（50和100 mM NaCl处理3 h）使表达量增加4–24倍。瞬时过表达后，O. sanctum、O. basilicum、O. gratissimum和O. kilimandscharicum中OkHMR转录水平分别增加2.1、1.8、3和5.36倍
- O. sanctum中β-榄香烯、石竹烯和germacrene D分别增加7.4%、37.87%和19.1%
- O. kilimandscharicum中germacrene A增加75%、β-石竹烯增加18.43%、germacrene D增加9.71%。在A. annua中表达增加2.4倍，总精油含量达0.64 mg/g（比对照高0.10 mg/g），青蒿素含量增加7.4%
- 在W. somnifera中叶片和果实表达分别增加3.5和2.8倍，总醉茄内酯含量增加44%，总甾醇仅增加0.5%。类胡萝卜素含量在Ocimum种中增加3–11%，在A. annua和W. somnifera叶片中增加33%。抑制剂处理（pravastatin和mevastatin）使O. kilimandscharicum过表达株系中OkHMR表达从5.3倍降至2.8–3.3倍，总精油含量降低18–25%
- A. annua中表达降至0.3–0.4倍
- W. somnifera中表达降至0.3–0.6倍，对照叶片总醉茄内酯减少96%，总甾醇减少39–43%。
研究结论
OkHMR是MVA途径的关键调控酶，对萜类（包括单萜、倍半萜、三萜及类胡萝卜素）的生物合成具有重要调控作用。OkHMR可作为代谢工程的有力工具，用于提高药用和芳香植物中萜类活性成分的含量。