Cloning and characterization of a pyrethroid pesticide decomposing esterase gene, Est3385, from Rhodopseudomonas palustris PSB-S
- 作者
- Xiangwen Luo, Deyong Zhang, Xuguo Zhou, Jiao Du, Songbai Zhang, Yong Liu
- 单位
- Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; University of Kentucky; Hunan Academy of Agricultural Sciences
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-25734-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
拟除虫菊酯类农药残留对环境和非靶标生物造成危害，需要鉴定和表征能够降解这些农药的新型酯酶，以减少农业生态系统中的农药残留。
研究策略
基于已发表的拟除虫菊酯降解酯酶保守序列，在沼泽红假单胞菌PSB-S基因组中挖掘候选酯酶基因Est3385，克隆并在E. coli中异源表达，纯化后表征其底物特异性、酶动力学和稳定性。
核心内容
从沼泽红假单胞菌PSB-S基因组中挖掘并克隆了一个新型拟除虫菊酯降解酯酶基因Est3385，并在大肠杆菌Rosetta中异源表达。该基因开放阅读框全长963 bp，编码蛋白预测分子量约33.94 kDa，重组蛋白带GST标签后约59 kDa。纯化后的酶最适温度为35°C，最适pH为6.0，对甲氰菊酯的Km为0.734 mmol/L，Vmax为0.918 U/μg。该酶可降解甲氰菊酯、氯氰菊酯等四种拟除虫菊酯，其中甲氰菊酯为最优底物。值得注意的是，Est3385缺乏已知酯酶中保守的Gly-X-Ser-X-Gly五肽基序却仍具催化活性。金属离子Fe³⁺抑制约63%活性，Cu²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺抑制约50%，而EDTA、PMSF和β-巯基乙醇不影响活性。该酶具有较宽的温度和pH耐受范围且不依赖辅助因子，展现出农药残留生物修复的应用潜力，但金属离子敏感性可能限制田间使用，有待蛋白质工程改良。
创新点
首次从红假单胞菌属中克隆并表征具有拟除虫菊酯降解活性的酯酶基因Est3385；该酶缺乏已知酯酶中保守的Gly-X-Ser-X-Gly五肽基序，但具有降解活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta | 拟除虫菊酯降解 | Est3385 | Est3385 | 催化 | 重组酯酶异源表达，降解拟除虫菊酯类农药，最优底物为甲氰菊酯 |
| Rhodopseudomonas palustris PSB-S | 拟除虫菊酯降解 | Est3385 (PSB-SGL0003385) | — | 催化 | 目的基因来源菌株，基因组中挖掘出酯酶基因Est3385 |
| Escherichia coli Rosetta | 重组蛋白表达 | GST (glutathione S-transferase) | GST标签 | 调控 | 用于融合蛋白纯化，没有降解活性 |
关键发现
- Est3385开放阅读框全长963 bp，编码蛋白预测分子量33.94 kDa（重组蛋白约59 kDa含GST标签）。最适温度35°C，最适pH
- 0；对甲氰菊酯的Km为0.734 ±
- 013 mmol·L⁻¹，Vmax为0.918 ±
- 025 U·μg⁻¹。可降解甲氰菊酯、氯氰菊酯等四种拟除虫菊酯，其中甲氰菊酯为最优底物。金属离子（Fe³⁺抑制约63%，Cu²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺抑制约50%）抑制活性；EDTA、PMSF、β-巯基乙醇不影响活性，DEPC轻微抑制（活性约91.83%）。
研究结论
Est3385是一种新型拟除虫菊酯降解酯酶，具有较宽的温度和pH耐受范围，无辅助因子需求，具备应用于农药残留生物修复的潜力，但金属离子抑制可能限制其田间应用，可通过蛋白质工程改良。