A Toolbox for Diverse Oxyfunctionalisation of Monoterpenes
- 作者
- Aitor Hernandez-Ortega, Maria Vinaxa, Ziga Zebec, Eriko Takano, Nigel S. Scrutton
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-32816-1
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏系统性表征的细胞色素P450酶库，无法实现对单萜骨架的受控氧官能团化以扩展萜类化学多样性。
研究策略
设计并构建包含多种CYP酶及其突变体的工具箱，结合非靶向GC/MS代谢组学方法，对15种单萜底物进行生物转化和产物谱分析，系统评估酶的活性与选择性。
核心内容
本研究构建了一个包含12个细胞色素P450酶及其变体的工具箱，用于单萜底物的可控氧官能团化。工具箱中包括8个CYP101A1变体、2个CYP102A1变体及1个CYP153A6变体，另评估了CYP108和CYP102A7但将其排除。作者以大肠杆菌为底盘，对15种无环、单环和双环单萜底物进行生物转化，并采用非靶向GC/MS代谢组学方法系统分析产物谱，实现了高通量、无偏见的酶活性和选择性评估。结果显示约70%的转化产物可通过GC/MS鉴定，共识别出53种已知产物和27种未知产物。多个酶展现出宽泛底物选择性，例如CYP101A1.1-3可转化多种底物，CYP102A1.Wt和CYP153A6.Wt也分别覆盖不同底物范围。该工具箱成功生成了somalrol、perillyl alcohol和verbenone等具有商业价值的氧化单萜产物，为单萜选择性氧化提供了丰富的生物催化模块，是代谢工程和级联生物催化生产高价值萜类化合物的重要资源。
创新点
首次报道了全面表征的CYP工具箱；将非靶向代谢组学应用于酶库筛选，实现高通量、无偏见的产物谱分析；为单萜氧化提供多样化生物催化部件。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.Wt | 催化 | 野生型（文献中为C334A变异体），天然底物D-樟脑，与PdR/PdX组成系统 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.1 | 催化 | 突变体Y96F |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.2 | 催化 | 突变体Y96F, V247L |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.3 | 催化 | 突变体F87W, Y96F, V247L |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.4 | 催化 | 突变体Y96F, L244A |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.5 | 催化 | 突变体F87W, Y96F, L244A |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.6 | 催化 | 突变体Y96F, L244A, V247A |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP101A1 | CYP101A1.7 | 催化 | 突变体Y96F, L244A, V247F |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP102A1 | CYP102A1.Wt | 催化 | 脂肪酸羟化酶野生型，自给自足型P450，含有FMN/FAD还原酶域 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP102A1 | CYP102A1.1 | 催化 | 三重突变体A264V, A328V, L437F |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP153A6 | CYP153A6Wt | 催化 | 烷烃羟化酶，可溶型P450，需要氧化还原伴侣 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP108 | CYP108 (P450terp) | 催化 | 因redoxin中铁硫辅因子未正确组装而被排除 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | CYP102A7 | CYP102A7 | 催化 | 因底物转化率低和功能稳定性差而被排除 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | pdR | Putidaredoxin reductase (PdR) | 催化 | CYP101A1系统的氧化还原伴侣，传递电子 |
| Escherichia coli | 单萜氧官能团化 | pdX | Putidaredoxin (PdX) | 催化 | CYP101A1系统的铁硫红氧还蛋白，传递电子 |
| Escherichia coli | 辅因子再生 | gdh | Glucose dehydrogenase (GDH) | 能量供给 | 用于NADH/NADPH再生，保证多轮催化 |
关键发现
- 构建了包含12个CYP酶的工具箱（8个CYP101A1变体、2个CYP102A1变体、1个CYP153A6变体，并评估了CYP108和CYP102A7但被排除）
- 对15种单萜底物（无环、单环、双环）进行筛选，约70%的产物可通过GC/MS鉴定
- 鉴定出53种已知产物（编号16-68）和27种未知产物（u1-u27）
- 多个酶表现出宽泛底物选择性，如CYP101A1.1-3可转化4、6-8、9-15号底物，CYP102A1.Wt可转化2-9和12-14号底物，CYP153A6.Wt可转化1-8号底物
- 生成了包括somalrol（祛痰药）、perillyl alcohol（镇痛及抗阿尔茨海默潜力）、verbenone（抗癌/信息素）等具有商业价值的氧化单萜产物。
研究结论
该CYP工具箱为单萜的选择性氧官能团化提供了丰富的生物催化模块，是代谢工程和级联生物催化生产高价值萜类化合物的重要资源。