Identification of novel sesquiterpene synthase genes that mediate the biosynthesis of valerianol, which was an unknown ingredient of tea
- 作者
- Jun-ichiro Hattan, Kazutoshi Shindo, Tetsuya Sasaki, Fumina Ohno, Harukuni Tokuda, Kazuhiko Ishikawa, Norihiko Misawa
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-30653-w
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
茶叶中未知成分缬草醇的合成基因未被鉴定，需要发现并功能验证催化缬草醇生物合成的倍半萜合酶基因。
研究策略
从Camellia hiemalis花中分离多个TPS基因（ChTps1a-g），在MVA途径工程化的大肠杆菌中异源表达，通过GC-MS和NMR鉴定主要产物为缬草醇；进一步对茶树中的同源基因CsTPS8（ChTPS1 R477H变体）进行功能验证，并检测茶叶中的缬草醇。
核心内容
本研究从冬青茶花中分离出7个高度相似的倍半萜合酶基因ChTps1a-g，并在工程化大肠杆菌MVA途径中异源表达。其中ChTps1a（ChTPS1）活性最高，编码554个氨基酸，含RDR、DDxxD和NSE/DTE保守基序，其主要产物经GC-MS和NMR鉴定为缬草醇，次要产物为hedycaryl（GC-MS显示为elemol）及一个未知倍半萜。首次鉴定出缬草醇合酶基因ChTps1。茶树同源基因CsTPS8（ChTPS1 R477H变体）同样产生缬草醇，产物总量平均增加40%，其中缬草醇峰面积增加46.5±6.0%。ChTps1d因缺失396-430氨基酸区域而失活，ChTPS1f的K541N替换使hedycaryl产量约为ChTPS1c的4倍。此外，在绿茶和红茶中均检出缬草醇，但强度约为重组大肠杆菌提取物的1/1000；纯化获得10.2 mg缬草醇，其对TPA诱导的EBV-EA激活有抑制作用（IC50约300 μM）。该工作首次鉴定缬草醇合成基因，并揭示缬草醇是此前未被识别的茶叶香气成分，为解析茶叶香气形成机制和合成生物学生产缬草醇提供了基础。
创新点
['首次鉴定出能够介导缬草醇合成的基因ChTps1（valerianol synthase）', '发现缬草醇是绿茶和红茶中的未知挥发性成分', '揭示了ChTPS1中R477H单氨基酸替换可使产量平均提高40%', '通过NMR彻底解析了缬草醇的结构']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径（工程化） | ChTps1（ChTps1a） | ChTPS1（缬草醇合酶） | 催化 | 从Camellia hiemalis花中分离的valerianol合酶基因，主要产物为valerianol，次要产物hedycaryl |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径（工程化） | CsTps8（ChTPS1 R477H变体） | CsTPS8 | 催化 | 来自茶树Camellia sinensis的TPS基因，与ChTPS1仅一个氨基酸差异（R477H），同样合成valerianol |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径（工程化） | ChTps1b, ChTps1c, ChTps1d, ChTps1e, ChTps1f, ChTps1g | ChTPS1b-g | 催化 | C. hiemalis中ChTps1的6个旁系同源基因，氨基酸替换或缺失导致活性变化，ChTPS1d因396-430缺失失活 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）途径 | pAC-Mev/Scidii/Aac（含MVA基因簇、Scidi、Aacl） | — | 能量供给 | 提供乙酰乙酸利用和IPP/DMAPP合成的MVA通路基因，包括乙酰乙酸-CoA连接酶（Aacl）和IPP异构酶（Scidi） |
关键发现
- ['从C. hiemalis花中分离出7个高度相似的TPS基因（ChTps1a-g），其中ChTps1a（ChTPS1）活性最高，编码554个氨基酸，分子量64.1 kDa，含有RDR、DDxxD和NSE/DTE保守基序', '在工程化大肠杆菌中，ChTPS1的主要产物经NMR鉴定为valerianol，次要产物为hedycaryl（GC-MS显示为elemol），以及一个未知倍半萜', 'ChTPS1 R477H变体（即CsTPS8）同样产生valerianol，产物总量平均增加40%，其中valerianol峰面积增加46.5 ± 6.0%（n=3）', 'ChTPS1d由于缺失396-430氨基酸区域而失活
- ChTPS1f的K541N替换使hedycaryl（峰1）产量约为ChTPS1c的4倍', '绿茶（Okumidori）、日本黑茶（Benihikari）和印度大吉岭黑茶中均检出valerianol，但强度约为重组大肠杆菌提取物的1/1000', 'valerianol对TPA诱导的EBV-EA激活有抑制作用，IC50约为300 μM，强于β-eudesmol（311 μM）、elemol（372 μM）、α-selinene（382 μM）和γ-amorphene（395 μM）', '纯化获得10.2 mg valerianol用于NMR结构解析']
研究结论
ChTps1基因编码缬草醇合酶，是第一个被鉴定的缬草醇合成基因；缬草醇存在于绿茶和红茶中，是之前未被识别的茶叶香气成分。