Analysis of the mechanisms regulating the expression of isoprenoid biosynthesis genes in hydroponically-grown Nicotiana benthamiana plants using virus-induced gene silencing
- 作者
- Go Atsumi, Uiko Kagaya, Noriko Tabayashi, Takeshi Matsumura
- 杂志
- Scientific Reports（2018）
- DOI
- 10.1038/s41598-018-32901-5
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
植物类异戊二烯次生代谢物的生物合成途径已被广泛研究，但其基因表达调控机制仍不清楚，且传统的转基因方法费时费力，难以快速分析基因功能。
研究策略
利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的病毒诱导基因沉默(VIGS)技术，在水培的本氏烟中下调类异戊二烯生物合成相关基因（HMGR1、CAS1、SSR2、SMT1等），通过实时PCR分析基因表达变化，结合GC/MS分析代谢物含量，从而揭示基因表达调控机制。
核心内容
本研究利用烟草脆裂病毒介导的病毒诱导基因沉默技术，在水培本氏烟中快速下调类异戊二烯生物合成途径的关键基因，以解析其表达调控机制。通过实时PCR和GC/MS分析，发现VIGS可有效将叶片中NbHMGR1、NbCAS1、NbSSR2、NbSMT1a转录水平降至约23%、12%、9%和11%。关键的是，沉默NbCAS1触发了新的反馈与前馈调控：上游NbHMGR1表达上调，下游NbSSR2和NbSMT1a表达分别降至约5%和不足60%，而NbSMT1b表达显著上调超过600倍，并伴随2,3-氧化鲨烯积累及胆固醇、菜油甾醇和豆甾醇含量下降。此外，NbSMT1a与NbSMT1b表现出拮抗性调控，且不同组织间调控模式存在差异。这些结果揭示了CAS1作为甾醇生物合成的核心调控节点，并证明了该水培VIGS系统是快速分析植物次生代谢基因功能的有效工具。
创新点
['建立了适用于水培本氏烟的TRV-VIGS系统，可在约2周内同时下调叶片、茎和根组织中的多个类异戊二烯生物合成基因', '发现NbCAS1敲低触发新的反馈和前馈调控：上游HMGR1表达上调，下游SSR2和SMT1a表达下调，而SMT1b表达显著上调（>600倍）', '发现NbSMT1a和NbSMT1b存在拮抗性调控，且不同组织间基因调控具有差异性']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | NbHMGSa/NbHMGSb | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 克隆及表达分析，非VIGS靶标 |
| Nicotiana benthamiana | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | NbHMGR1a/NbHMGR1b | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1 | 催化 | VIGS靶标，敲低后表达受CAS1反馈调控 |
| Nicotiana benthamiana | 类异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | NbMVKa/NbMVKb | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 克隆及表达分析，非VIGS靶标 |
| Nicotiana benthamiana | 甾醇生物合成 | NbCAS1a/NbCAS1b | 环阿乔醇合酶1 | 催化 | VIGS靶标，敲低引发关键调控 |
| Nicotiana benthamiana | 甾醇生物合成 | NbSSR2a/NbSSR2b | 甾醇侧链还原酶2 | 催化 | VIGS靶标，参与胆固醇合成 |
| Nicotiana benthamiana | 甾醇生物合成 | NbSMT1a/NbSMT1b | S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的C-24甾醇甲基转移酶1 | 催化 | VIGS靶标，两个同源拷贝存在拮抗调控 |
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素生物合成 | NbPDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 用于VIGS效率评价的标记基因 |
关键发现
- VIGS分别将叶片中NbHMGR1、NbCAS1、NbSSR2、NbSMT1a转录水平降至约23%、12%、9%和11%
- 茎中降至26%、17%、17%和11%
- 根中降至31%、22%、14%和6%，NbSMT1b在根中降至约40%。NbCAS1敲低使NbSSR2和NbSMT1a表达降至约5%和<60%，而NbSMT1b表达上调>600倍
- NbHMGR1表达在叶片中显著上调。GC/MS显示NbCAS1敲低增加2,3-氧化鲨烯积累，减少胆固醇、菜油甾醇和豆甾醇
- NbSSR2敲低降低胆固醇
- NbSMT1敲低增加胆固醇并减少菜油甾醇和豆甾醇。同时沉默NbSSR2和NbSMT1未引起NbHMGR1上调。
研究结论
本研究建立的水培本氏烟VIGS系统能够快速有效地沉默类异戊二烯生物合成基因，并成功揭示了新的反馈和前馈调控机制，特别是CAS1作为重要调控节点，以及SMT1a/SMT1b的拮抗性调控，为植物次生代谢基因调控研究提供了有力工具。