SMRT- and Illumina-based RNA-seq analyses unveil the ginsinoside biosynthesis and transcriptomic complexity in Panax notoginseng
- 作者
- Dan Zhang, Wei Li, Zhong-jian Chen, Fu-gang Wei, Yun-long Liu, Li-zhi Gao
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-72291-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
三七（Panax notoginseng）中人参皂苷生物合成途径尚不清楚，缺乏全长转录组注释，限制了对皂苷生物合成机制的理解及其在工业生物合成和遗传育种中的应用。
研究策略
结合单分子实时（SMRT）测序和第二代测序（SGS）技术，对三七根、根茎、茎、叶、花等组织进行全长转录组测序，构建高质量参考转录组，并通过比较转录组和代谢组分析解析人参皂苷生物合成机制。
核心内容
本研究首次将PacBio单分子实时测序与Illumina二代测序相结合，对三七的根、根茎、茎、叶、花等组织进行全长转录组测序，系统解析了人参皂苷生物合成的分子机制。共获得237,368个全长非嵌合读段，校正后得到51,040个非冗余转录本，其N50达2.9 Kb（最大20,087 bp），显著优于Illumina组装的1.6 Kb。该策略纠正了1,925个错误注释基因并合并为927个新基因，同时鉴定出8,111个新转录异构体和2,664个新lncRNA。从SMRT数据中鉴定出20,015个可变剪接事件（对应6,324个基因），多于Illumina鉴定的18,498个，且花中异构体最为丰富（16,224个，占22.28%）。代谢组分析检测到17种特征性人参皂苷，三年生植物根部含量最丰富，根部以原人参三醇型和原人参二醇型为主，地上部分则以原人参二醇型为主。共鉴定出23个参与皂苷生物合成的基因家族215条unigenes，其中CYP450和GT家族分别有170和189个独特异构体，表明组织特异性异构体支撑了皂苷的组织特异性积累。此外，检测到三七约在26.15百万年前发生的一次全基因组复制事件。该高质量全长转录组显著改善了三七基因组注释，揭示了皂苷生物合成途径的复杂性，为三七的遗传改良和代谢工程奠定了重要基础。
创新点
首次在三七中应用PacBio SMRT测序获得全长转录组；纠正了1925个错误注释基因并合并为927个新基因；鉴定出8111个新转录异构体和2664个新lncRNA；从SMRT数据中鉴定出比Illumina更多的可变剪接事件；揭示人参皂苷生物合成主要在花中发生并由组织特异性异构体支持。
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ACAT | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | MVA途径第一个酶，花中高表达 |
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | MVA途径酶 |
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径关键酶，具有10个可变剪接异构体 |
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | MVA途径酶 |
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | MVA途径酶 |
| Panax notoginseng | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MDD | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | MVA途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 | 催化 | MEP途径第一个酶，具有11个可变剪接异构体 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | MCT | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | CMK | 4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | MDS | 2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | HDS | 4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯基二磷酸合酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径 | HDR | 4-羟基-3-甲基丁烯-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | MEP途径酶 |
| Panax notoginseng | 萜类前体合成 | IPI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | IPP/DMAPP异构化 |
| Panax notoginseng | 萜类前体合成 | GPS | 牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 合成GPP |
| Panax notoginseng | 萜类前体合成 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 合成FPP |
| Panax notoginseng | 萜类前体合成 | GGPS/GGR | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶/还原酶 | 催化 | 合成GGPP，具有10个可变剪接异构体 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架合成 | SS | 角鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子FPP合成角鲨烯 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架合成 | SE | 角鲨烯环氧酶 | 催化 | 催化角鲨烯生成2,3-氧化角鲨烯，具有9个可变剪接异构体 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架合成 | DDS | 达玛烯二醇合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化角鲨烯环化形成达玛烯二醇 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架合成 | AS | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化角鲨烯环化形成β-香树脂醇 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架修饰 | CYP450 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 参与三萜骨架的羟基化等修饰，共有170个独特异构体 |
| Panax notoginseng | 三萜骨架修饰 | UGT/GT | UDP-依赖的糖基转移酶 | 催化 | 参与人参皂苷糖基化修饰，共有189个独特异构体 |
| Panax notoginseng | 人参皂苷生物合成 | Pno31426 | 未知蛋白 | 调控 | 示例基因，SMRT检测到7个剪接异构体，仅1个被Illumina检测到 |
关键发现
- 获得237,368个全长非嵌合（FLNC）读段
- 校正后得到51,040个非冗余转录本
- SMRT转录本N50为2.9 Kb（最大20,087 bp），优于Illumina组装（N50 1.6 Kb，最大16,703 bp）
- 从SMRT数据鉴定20,015个可变剪接事件（对应6,324个基因），从Illumina数据鉴定18,498个（对应9,550个基因）
- 花中可变剪接异构体最多（16,224，占22.28%）
- 鉴定出23个参与人参皂苷生物合成的基因家族共215条unigenes，其中CYP450和GT家族分别有170和189个独特异构体
- HPLC检测到17种特征性人参皂苷（Rb1、Rb2、Rd、Re、R1、Rg1等），三年生植物根部皂苷含量最丰富
- 根部富含原人参三醇型和原人参二醇型皂苷，而地上部分（叶、茎、花）以原人参二醇型为主
- 检测到三七中一次全基因组复制事件约在26.15百万年前发生，Ks峰值约0.34。
研究结论
高质量SMRT全长转录组显著改善了三七基因组注释，揭示了人参皂苷生物合成途径的复杂性和组织特异性，为三七的遗传改良和代谢工程奠定了重要基础。