Identification and the potential involvement of miRNAs in the regulation of artemisinin biosynthesis in A. annua
- 作者
- Shazia Khan, Athar Ali, Monica Saifi, Parul Saxena, Seema Ahlawat, Malik Zainul Abdin
- 单位
- Department of Biotechnology, Jamia Hamdard; Department of Botany, Jamia Hamdard; M/S Sandor Lifesciences Pvt Ltd
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-69707-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素在黄花蒿中含量极低，其生物合成的调控机制尚未完全阐明，尤其是miRNA对青蒿素生物合成途径的调控作用未知。
研究策略
利用Illumina NextSeq 500高通量小RNA测序鉴定黄花蒿叶中的保守及新型miRNA，并通过stem-loop RT-PCR验证；预测miRNA靶基因，结合qRT-PCR分析miRNA与其靶基因在不同发育阶段的表达相关性，揭示miRNA对青蒿素生物合成的潜在调控作用。
核心内容
本研究通过Illumina NextSeq 500高通量小RNA测序，对黄花蒿叶片中的miRNA进行了系统鉴定，共获得121个miRNA，其中80个属23个保守家族，41个为黄花蒿特异的新型miRNA。最丰富的miR396f读数达261,298 RPM，miR159a为73,683 RPM；新型miRNA的最小折叠能在-18.3至-84.4 kcal/mol之间。通过靶基因预测和qRT-PCR表达关联分析，发现多个miRNA靶向青蒿素生物合成途径关键酶基因（如CPR、DXR1、ADS、CYP71AV1）及转录因子（MYB1、NAC1、WRKY1、MYC2），其中miR159与CPR表达呈显著负相关（Pearson系数-0.68），miR858与MYB1及ADS表达负相关（-0.52和-0.50），而miR5083与NAC1、miRN-7与DBR2表达呈正相关（+0.4和+0.39）。这些结果揭示了miRNA通过靶向关键酶基因和转录因子参与青蒿素生物合成的调控网络，为通过miRNA工程理性提升青蒿素产量提供了新靶点和理论依据。
创新点
首次在黄花蒿中鉴定出miR396、miR319、miR399、miR858、miR5083和miR6111等保守miRNA家族；发现多个miRNA靶向青蒿素生物合成途径的关键酶基因（如CPR、DXR1、ADS、CYP71AV1）及转录因子（MYB1、NAC1、WRKY1、MYC2）；部分miRNA靶向基因启动子区域，如miRN-7靶向DBR2启动子。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | CPR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | CYP71AV1的氧化还原伴侣，参与青蒿酸合成三步氧化反应；被miR159、miR166、miR172及多个新型miRNA靶向 |
| Artemisia annua | MEP途径 | DXR1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 质体MEP途径限速酶；被miR396家族成员靶向 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | ADS | 紫穗槐-4,11-二烯合酶 | 催化 | 催化法尼基焦磷酸形成紫穗槐二烯的关键酶；被miR858靶向 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 催化紫穗槐二烯氧化为青蒿酸；被miRN-11、miRN-17、miRN-18靶向 |
| Artemisia annua | MVA/MEP途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径关键酶；被多个miRNA靶向 |
| Artemisia annua | MVA/MEP途径 | IDI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 参与IPP与DMAPP互变；被miRNA靶向 |
| Artemisia annua | MEP途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个关键酶；被miRNA靶向 |
| Artemisia annua | MEP途径 | HDR | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | MEP途径末端酶；被miRNA靶向 |
| Artemisia annua | MVA途径 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP生成FPP；被miRNA靶向 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | DBR2 | 青蒿醛Δ11(13)双键还原酶 | 催化 | 催化青蒿醛还原为二氢青蒿醛；miRN-7和miR166i靶向其启动子 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成途径 | ALDH1 | 醛脱氢酶 | 催化 | 催化二氢青蒿醛氧化为二氢青蒿酸 |
| Artemisia annua | 调控网络 | MYB1 | MYB转录因子 | 调控 | 调控ADS和CYP71AV1表达；被miR858靶向 |
| Artemisia annua | 调控网络 | NAC1 | NAC转录因子 | 调控 | 正调控ADS和CYP71AV1；被miR403和miR5083靶向 |
| Artemisia annua | 调控网络 | WRKY1 | WRKY转录因子 | 调控 | 结合ADS启动子W盒正调控青蒿素合成；被miR166g靶向 |
| Artemisia annua | 调控网络 | MYC2 | bHLH转录因子 | 调控 | 茉莉酸响应转录因子；被miRN-26和miRN-41靶向 |
| Artemisia annua | 调控网络 | ERF1 | AP2/ERF转录因子 | 调控 | 正调控青蒿素生物合成；其启动子被miR159、miR172a-3p、miRN-10靶向 |
| Artemisia annua | 萜类竞争途径 | β-amyrin synthase | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 竞争碳流；被新型miRN-4等靶向 |
| Artemisia annua | 萜类竞争途径 | β-farnesene synthase | β-法尼烯合酶 | 催化 | 竞争碳流；被miRN-26等靶向 |
| Artemisia annua | 萜类竞争途径 | linalool synthase | 芳樟醇合酶 | 催化 | 竞争碳流；被miRN-20等靶向 |
| Artemisia annua | 苯丙烷途径 | chalcone synthase | 查尔酮合酶 | 催化 | 被miR162靶向，可能影响类黄酮合成 |
关键发现
- 共鉴定121个miRNA，其中80个保守miRNA隶属23个家族，41个为黄花蒿特异新型miRNA
- 最丰富的miRNA为miR396f，读数为261,298 RPM
- miR159a为73,683 RPM
- 新型miRNA的最小折叠能（MFE）在-18.3至-84.4 kcal/mol之间，MFEI为0.87-2.1
- miR159与CPR表达呈负相关（Pearson系数-0.68）
- miR858与MYB1及ADS表达呈负相关（Pearson系数-0.52和-0.50）
- miR5083与NAC1表达呈正相关（Pearson系数+0.4）
- miRN-7与DBR2表达呈正相关（Pearson系数+0.39）。
研究结论
miRNA通过靶向青蒿素生物合成途径的关键酶基因和转录因子，可能在调控青蒿素积累中发挥重要作用；这些发现为通过miRNA工程理性改良青蒿素生物合成提供了新靶点和理论依据。