Construction of an artificial system for ambrein biosynthesis and investigation of some biological activities of ambrein
- 作者
- Yota Yamabe, Yukina Kawagoe, Kotone Okuno, Mao Inoue, Kanako Chikaoka, Daijiro Ueda, Yuko Tajima, Tadasu K. Yamada, Yoshito Kakihara, Takashi Hara, Tsutomu Sato
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-76624-y
- 所属领域
- 代谢工程；合成生物学
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解决的核心问题
高效合成龙涎香主要成分ambrein及其气味化合物，并探索其新的生物活性；现有化学合成和生物合成产量低，且天然来源稀缺。
研究策略
通过蛋白质工程改造细菌三萜合酶BmeTC，创建新型ambrein合成酶BmeTCY167A/D373C，构建体外双酶系统高效合成ambrein；利用单线态氧光氧化系统将ambrein高效转化为挥发性气味成分；通过细胞实验评估ambrein的骨细胞分化调节和神经保护活性。
核心内容
该研究通过蛋白质工程改造细菌三萜合酶BmeTC，构建了龙涎香主要成分龙涎酮（ambrein）的人工生物合成系统，并探索了其新生物活性。研究者将BmeTC的D373位点突变为Cys，获得可产生ambrein的突变体；进一步引入Y167A双突变，使ambrein产率从2.2%提升至21.5%。随后，通过加入野生型BmeTC构建双酶系统，产率进一步提高到46.0%，约为原始最佳系统的20倍。同时，研究建立了一种单线态氧光氧化转化系统，可将ambrein高效转化为挥发性气味成分，其中光敏剂亚甲基蓝处理产生的龙涎醚含量比天然龙涎香高6至21倍。细胞实验表明，10微摩尔龙涎酮可显著促进破骨细胞分化，且低浓度预处理能抑制淀粉样蛋白诱导的神经细胞凋亡。该研究不仅实现了龙涎香替代品的高效生物合成，还发现了其潜在的骨代谢调节和神经保护功能，为相关药物开发提供了新方向。
创新点
1. 首次创建“ambrein synthase”（BmeTCY167A/D373C），ambrein产量比之前最佳系统提高约20倍；2. 建立高效光氧化转化系统，挥发性产物产率达8-15%；3. 首次发现ambrein促进破骨细胞分化并抑制Aβ诱导的神经细胞凋亡。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成（鲨烯环化） | BmeTCY167A/D373C | BmeTCY167A/D373C（ambrein synthase） | 催化 | 新型双突变酶，用于体外高效合成ambrein，产率21.5% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成（鲨烯环化） | BmeTCWT | BmeTCWT | 催化 | 野生型酶，配合ambrein synthase加速第一步反应，双酶系统产率46.0% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成（鲨烯环化） | BmeTCD373C | BmeTCD373C | 催化 | 对照酶，ambrein产率2.2% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成（鲨烯环化） | BmeTCL596A | BmeTCL596A | 催化 | 单点突变，从10合成1的产率是野生型的8倍 |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成（鲨烯环化） | BmeTCY167A/D373C | BmeTCY167A/D373C（ambrein synthase） | 催化 | 预测在毕赤酵母中表达可实现约2 g/L的ambrein产量 |
| — | 三萜生物合成（鲨烯环化） | SHCD377C | SHCD377C | 催化 | 鲨烯-藿烯环化酶变体，用于将6转化为单环中间体10 |
关键发现
- 在D373位点仅Cys突变（D373C）可使BmeTC产生ambrein，产率为12.5%
- 双突变体BmeTCY167A/D373C从6合成1的产率为21.5%，比BmeTCD373C（2.2%）提高约10倍
- 加入BmeTCWT后双酶系统从6合成1的产率达46.0%，约为BmeTCD373C的20倍
- L596A变体从10合成1的产率是野生型的8倍
- 光氧化转化中，可见光+光敏剂（RB、TPP、MB）处理1的挥发性产物产率为8-15%，残留率0-13%；MB处理产生的3（ambrox）含量比天然龙涎香高6-21倍
- 10μM的1显著促进破骨细胞分化，50μM效果与5μM kenpaullone相当；1-20μM预处理可抑制1μM Aβ1-42诱导的SK-N-SH细胞凋亡。
研究结论
成功构建了人工合成系统，实现ambrein及其气味化合物的高效生产，并发现ambrein具有促进破骨细胞分化和预防Aβ神经毒性的新活性，为龙涎香替代品和药物开发提供了新途径。