Multiple gene substitution by Target-AID base-editing technology in tomato
- 作者
- Johan Hunziker, Keiji Nishida, Akihiko Kondo, Sanae Kishimoto, Tohru Ariizumi, Hiroshi Ezura
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-77379-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在番茄中实现多个类胡萝卜素相关基因的精准碱基替换，避免传统CRISPR/Cas9产生indel导致基因敲除带来的致死效应，并用于品种改良。
研究策略
利用Target-AID碱基编辑技术，将nCas9与胞苷脱氨酶(CDA)和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)融合，并通过多个sgRNA同时靶向SIDDB1、SIDET1和SICY-C-B三个基因，诱导胞嘧啶到胸腺嘧啶的替换，从而在多基因中引入点突变。
核心内容
该研究在番茄中首次应用Target-AID碱基编辑技术，通过将nCas9与胞苷脱氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂融合，并利用多个sgRNA同时靶向类胡萝卜素合成通路中的SIDDB1、SIDET1和SICY-C-B三个基因，实现胞嘧啶到胸腺嘧啶的精准替换，从而引入点突变而非传统CRISPR/Cas9造成的indel，避免了基因敲除带来的致死效应。结果显示，12个T0转基因系中有11个（91.6%）同时携带三个靶基因的替换突变，并获得多个等位基因版本，如SIDDB1中Ala→Thr、SIDET1中Pro→Phe等替换，以及SICY-C-B中引入提前终止密码子。T1代纯合株系中，番茄红素含量在#43-2_2中为44.63 μg/g FW，较对照（30.75）增加约45%；β-胡萝卜素在#16-3_3中达4.19 μg/g FW，较对照（2.02）增加超过2倍，总叶绿素含量也显著提升。所有检测系均未发现脱靶突变。该研究证明Target-AID是一种高效且精准的多基因碱基替换工具，可在番茄中同时产生多种等位基因变异，为作物育种提供了新的技术途径。
创新点
首次在番茄中实现多基因同时碱基替换；在T0代即获得多个等位基因版本；替换效率高达91.6%；未检测到脱靶效应；该方法可避免indel引起的致死问题。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) | 类胡萝卜素生物合成 | SIDDB1 | DNA损伤结合蛋白1 (DDB1) | 调控 | 靶向编码区，获得Ala→Thr或Asp→His/Tyr等替换，影响光信号转导，调控类胡萝卜素积累。 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) | 类胡萝卜素生物合成 | SIDET1 | DEETIOLATED1 (DET1) | 调控 | 靶向编码区，产生Pro→Phe、Asp→Val等替换，影响光形态建成和类胡萝卜素积累。 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) | 类胡萝卜素生物合成 | SICY-C-B | 番茄红素β-环化酶 (CYC-B) | 催化 | 通过引入终止密码子产生截短蛋白，改变番茄红素/β-胡萝卜素比例及类胡萝卜素组成。 |
| — | — | — | nCas9-CDA-UGI融合蛋白 (Target-AID系统组件) | 催化 | nCas9切口酶与胞苷脱氨酶(CDA)及尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)融合，催化靶位点C→T替换，降低indel形成。 |
关键发现
- 在12个T0转基因系中，11个（91.6%）同时携带三个靶基因的替换突变。T1代纯合突变株系中，番茄红素含量在#43-2_2中为44.63 μg/g FW（对照WT为30.75），约增加45%
- 在#16-3_3中为40.51 μg/g FW，约增加30%。β-胡萝卜素在#16-3_3中为4.19 μg/g FW（对照2.02），增加超过2倍
- 在#43-2_2中为4.03 μg/g FW，也显著增加。绿色成熟期总叶绿素含量：#16-3_3为69.34 μg/g FW（WT为26.40），#43-2_2为51.81 μg/g FW。多个等位版本获得：SIDDB1中Ala→Thr、Asp→His/Tyr替换
- SIDET1中Pro→Phe、Asp→Val等
- SICY-C-B中引入提前终止密码子。所有检测的T0/T1系均未发现脱靶突变。
研究结论
Target-AID是一种高效的多基因碱基替换工具，能够在番茄中同时引入多个基因的点突变，产生多种等位基因，为育种提供了新途径。