Evaluation of spore inoculum and confirmation of pathway genetic blueprint of T13αH and DBAT from a Taxol-producing endophytic fungus
- 作者
- Balabhadrapatruni V. S. K. Chakravarthi, Satpal Singh, Subban Kamalraj, Vijai Kumar Gupta, Chelliah Jayabaskaran
- 杂志
- Scientific Reports（2020）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-77605-x
- 所属领域
- 发酵工程
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解决的核心问题
内生真菌Fusarium solani产紫杉醇和巴卡亭III产量低，缺乏以孢子为接种物的系统培养优化，且其紫杉醇生物合成通路基因尚未充分确认。本文旨在通过孢子接种和培养基筛选提高产量，并克隆关键基因T13αH和DBAT以验证通路遗传蓝图。
研究策略
在五种固体培养基上评估F. solani的菌丝生长、产孢和孢子萌发，以M1D培养基萌发孢子（萌发率94.76%）作为种子接种物，在五种液体培养基（PDB、M1DB、S7B、FBB、MFBB）中于静态和摇瓶条件下培养28天，检测生物量及紫杉醇/巴卡亭III产量（CIEA法），并通过RT-PCR克隆T13αH和DBAT基因片段。
核心内容
本研究以产紫杉醇内生真菌Fusarium solani为对象，针对其紫杉醇和巴卡亭III产量低、孢子接种缺乏系统优化及通路基因未确认的问题，在五种固体培养基上评估菌丝生长、产孢及孢子萌发，选择M1D中萌发率最高（94.76%）的孢子作为种子接种物，于五种液体培养基中静态和摇瓶培养28天检测产量，并通过RT-PCR克隆关键基因。结果显示，MFBB摇瓶培养下紫杉醇产量最高达136.3 μg/L，巴卡亭III为128.3 μg/L；FBB静态培养生物量最高（12.1 g/L），S7B产量最低（紫杉醇6.8 μg/L）。同时成功克隆T13αH（563 bp）和DBAT（621 bp）基因片段，与Taxus序列同源性均超过98%，其中T13αH催化残基HXXXD保守。产物经HPLC、LC-ESI-MS和1H NMR确认。该研究证实F. solani具有独立完整的紫杉醇合成遗传蓝图，孢子接种结合MFBB培养可显著提升产量，为后续代谢工程改造奠定基础。
创新点
首次系统评估以孢子为接种物对F. solani产紫杉醇和巴卡亭III的影响；确定MFBB为最优产紫杉醇培养基（136.3 μg/L）；从该真菌中克隆证明T13αH（563 bp）和DBAT（621 bp）基因存在，序列与Taxus同源性>98%。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium solani | 紫杉醇生物合成 | T13αH | taxane 13α-hydroxylase | 催化 | 563 bp部分cDNA片段，催化5α-羟基紫杉二烯转变为5α,13α-二羟基紫杉二烯；含HXXXD催化残基，与Taxus cuspidata同源性98% |
| Fusarium solani | 紫杉醇生物合成 | DBAT | 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase | 催化 | 621 bp部分cDNA片段，催化10-去乙酰巴卡亭III乙酰化；与Taxus × media和T. cuspidata同源性98.5% |
关键发现
- MFBB摇瓶条件下紫杉醇最高产量为136.3 μg/L，巴卡亭III为128.3 μg/L
- M1DB中孢子萌发率最高（94.76%）
- FBB静态培养生物量最高（12.1 g/L）
- S7B产量最低（紫杉醇6.8 μg/L，巴卡亭III 4.9 μg/L）
- T13αH片段563 bp，DBAT片段621 bp，与Taxus序列同源性均>98%
- HXXXD催化残基在T13αH中保守
- 真菌紫杉醇和巴卡亭III经HPLC、LC-ESI-MS和1H NMR确认。
研究结论
使用M1D中萌发的孢子作为接种物并结合MFBB摇瓶培养，可显著提高F. solani的紫杉醇（136.3 μg/L）和巴卡亭III（128.3 μg/L）产量，且该真菌中存在与Taxus同源的T13αH和DBAT基因，证实其具有紫杉醇生物合成的独立遗传蓝图，为后续代谢工程改造提高产量奠定了基础。