CRISPR-based transcriptional activation tool for silent genes in filamentous fungi
- 作者
- László Mózsik, Mirthe Hoekzema, Niels A. W. de Kok, Roel A. L. Bovenberg, Yvonne Nygård, Arnold J. M. Driessen
- 杂志
- Scientific Reports（2021）
- DOI
- 10.1038/s41598-020-80864-3
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
丝状真菌基因组中存在大量沉默的生物合成基因簇，在实验室条件下不表达，难以发现新化合物，需要通用的转录激活方法。
研究策略
利用CRISPRa技术，将核酸酶缺陷型dCas9与三部分转录激活因子VPR融合，构建基于AMA1自主复制载体的单质粒系统，通过可更换的sgRNA靶向目标启动子，实现无基因组编辑的转录激活。
研究路线图
核心内容
本研究开发了一种基于CRISPRa的转录激活工具，用于激活丝状真菌中沉默的生物合成基因簇。研究人员将核酸酶缺陷型dCas9与三部分激活因子VPR融合，构建了基于AMA1自主复制载体的单质粒系统，并通过Golden Gate克隆和蓝白筛选实现了sgRNA的快速更换，无需基因组编辑即可靶向启动子。在Penicillium rubens中，针对penDE启动子设计的6个sgRNA均显著增强DsRed荧光，其中sgRNA_c效果最佳；针对macrophorin基因簇启动子macR的20个sgRNA中，sgRNA_4和sgRNA_5成功激活该沉默簇。激活菌株AMA18.4的macR表达水平与强启动子过表达菌株相当，macrophorin A产量达到过表达菌株的15%，且浓缩上清对Micrococcus luteus具有抗菌活性。该工具为快速发现丝状真菌中的新型抗菌化合物提供了通用平台。
创新点
1) 首次在Penicillium rubens中实现基于dCas9-VPR的CRISPRa；2) 设计了sgRNA“plug-and-play”模块，利用Golden Gate克隆和蓝白筛选方便更换靶点；3) 成功激活了沉默的macrophorin基因簇，产生具有抗菌活性的macrophorin类化合物。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Penicillium rubens DS68530 | penDE核心启动子（来自青霉素生物合成基因簇） | — | dCas9-VPR | 调控 | CRISPRa转录激活因子，靶向penDE-CP激活DsRed荧光报告基因 |
| Penicillium rubens DS68530 | macrophorin生物合成基因簇 | macR | MacR | 调控 | 途径特异性转录因子，CRISPRa靶向其启动子导致BGC激活 |
| Penicillium rubens DS68530 | macrophorin生物合成基因簇 | macA | — | 催化 | 聚酮合酶，macR激活后转录上调 |
| Penicillium rubens DS68530 | macrophorin生物合成基因簇 | macJ | — | 催化 | 推测的萜烯环化酶，转录上调 |
关键发现
- 在penDE-CP_DsRed激活中，6个sgRNA中6个均显示荧光增强（BioLector），其中penDE-sgRNA_c最有效
- 20个靶向macR启动子的sgRNA中，2个（sgRNA_4和sgRNA_5）成功激活macrophorin BGC
- 菌株AMA18.4中macR表达水平与强启动子过表达菌株macR:OE相当，AMA18.5约为macR:OE的三分之一
- AMA18.4产量分别为macR:OE的macrophorin A 15%、4'-oxomacrophorin D 13%、macrophorin D约38%
- 生物测定显示AMA18.4和macR:OE的浓缩上清对Micrococcus luteus有抑制圈。
研究结论
本研究开发的CRISPRa工具可快速、方便地激活丝状真菌沉默BGC，有助于新型抗菌化合物的发现。