Phenotypic and Genomic Analysis of Clostridium beijerinckii NRRL B-598 Mutants With Increased Butanol Tolerance
- 作者
- Maryna Vasylkivska, Barbora Branska, Karel Sedlar, Katerina Jureckova, Ivo Provaznik, Petra Patakova
- 单位
- Department of Biotechnology, University of Chemistry and Technology, Prague, Prague, Czechia; Department of Biomedical Engineering, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Brno, Czechia
- 杂志
- Frontiers in Bioengineering and Biotechnology（2020）
- DOI
- 10.3389/fbioe.2020.598392
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
ABE发酵中丁醇对生产菌株的毒性导致细胞膜破坏、细胞活力低和丁醇产量低，需要获得丁醇耐受性提高的突变菌株并解析其遗传基础。
研究策略
采用三种随机化学诱变策略（EMS+丁醇筛选、EMS+溴化乙锭EB筛选、EB直接诱变筛选）获得丁醇耐受突变株，通过表型分析（耐受性、代谢产物）和全基因组测序比较突变位点。
核心内容
该研究以溶剂发酵梭菌Clostridium beijerinckii NRRL B-598为对象，针对丁醇毒性限制ABE发酵产量的核心问题，采用三种随机化学诱变策略（EMS联合丁醇筛选、EMS联合溴化乙锭筛选及EB直接诱变）获得丁醇耐受突变株，并综合表型分析与全基因组测序解析其遗传基础。结果显示，共获得9株稳定耐受突变株，丁醇耐受性较野生型（11±1 g/L）提高36%至127%，最高可达25.0 g/L；乙醇耐受性从38.5±2.1 g/L提升至55.0 g/L。在添加CaCO₃条件下，EB突变株A和C的丁醇产量达8.1±0.2 g/L，较无缓冲条件提高11%–16%，突变株B的产量为4.7±0.5 g/L，较对照提高约12倍；突变株C在生物反应器中比生长速率达0.48±0.01 h⁻¹，显著高于野生型的0.32±0.03 h⁻¹。全基因组测序发现每个突变株含1–17个SNP，S层蛋白、细胞色素b5等基因突变在多个菌株中重复出现，并鉴定出两个外排泵调控因子基因（MarR家族X276_07980和MerR家族X276_24400）的突变。该研究首次将EB用于溶剂发酵梭菌丁醇耐受菌株开发，证实随机诱变可有效提升耐受性且不损害溶剂生产能力，外排泵调控因子为后续理性代谢改造提供了新靶点。
创新点
首次将EB作为诱变剂或筛选剂用于溶剂发酵梭菌的丁醇耐受菌株开发；发现外排泵调控因子基因（X276_07980和X276_24400）的突变与丁醇耐受性提高相关，为理性改造提供新靶点。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_07980 | MarR家族转录调控因子 | 调控 | EMS+EB突变株E15中突变，可能影响外排泵表达 |
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_24400 | MerR家族转录调控因子 | 调控 | EMS+EB突变株E28中突变，可能影响外排泵表达 |
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_22865 | 碳水化合物ABC转运蛋白通透酶 | 转运 | EB突变株A、B、C中均发生突变 |
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_03000 | AAA家族ATPase | 能量供给 | EB突变株A、B、C中均发生突变 |
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_13415 | S-layer家族蛋白 | 区室化 | 在5个突变株中检测到突变，可能影响细胞表面结构 |
| Clostridium beijerinckii NRRL B-598 | ABE发酵（丙酮-丁醇-乙醇） | X276_26470 | 脂蛋白二酰甘油转移酶 | 催化 | EMS+丁醇突变株B33中突变，可能涉及脂蛋白加工 |
关键发现
- 获得9株稳定丁醇耐受突变株，耐受性提高36%至127%（野生型丁醇耐受11±1 g/L，突变株最高可耐受25.0 g/L）
- 乙醇耐受从野生型38.5±2.1 g/L提高到最高55.0 g/L
- EB耐受从野生型1.75±0.40 mg/L提高到最高5 mg/L
- 突变株对四环素和氯霉素耐受性变化，链霉素耐受性下降
- 在添加CaCO3条件下，EB突变株A和C丁醇产量达8.1±0.2 g/L（较无缓冲条件提高11-16%），突变株B丁醇产量4.7±0.5 g/L（几乎12倍提高）
- 突变株C在生物反应器中比生长速率0.48±0.01 h^-1，高于野生型0.32±0.03 h^-1
- 全基因组测序发现每个突变株含1-17个SNP，在多个突变株中重复出现S层蛋白（X276_13415）、细胞色素b5（X276_14460）等基因突变
- EMS+EB突变株E15和E28分别在X276_07980（MarR家族调控因子）和X276_24400（MerR家族调控因子）发生突变。
研究结论
随机化学诱变结合EB可成功获得丁醇耐受性显著提高的溶剂发酵梭菌突变株，且EB诱变未破坏溶剂生产能力；突变导致的耐受性增强与典型应激反应基因（趋化、自溶、细胞膜结构）及外排泵调控因子突变有关，外排泵调控因子是提高丁醇耐受性的潜在理性改造靶点。