Phosphatidic acid directly activates mTOR and then regulates SREBP to promote ganoderic acid biosynthesis under heat stress in Ganoderma lingzhi
- 作者
- Yong-Nan Liu, Yu-Lin Chen, Zi-Juan Zhang, Feng-Yuan Wu, Hao-Jin Wang, Xiao-Ling Wang, Gao-Qiang Liu
- 杂志
- Communications Biology（2024）
- DOI
- 10.1038/s42003-024-07225-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
热胁迫下磷脂酸(PA)通过何种分子机制调控灵芝酸生物合成尚不清楚，尤其是PA的下游靶蛋白及其信号转导途径。
研究策略
通过蛋白质组学筛选PA结合蛋白，结合体外pull-down和体内免疫共沉淀验证PA与mTOR的相互作用；利用药理学抑制剂（1-丁醇、雷帕霉素、fatostatin）、RNA干扰沉默pld、mTOR和SREBP基因，以及Western blot、qRT-PCR、代谢物测定和EMSA等手段，系统阐明PLD-PA-mTOR-SREBP信号通路在热胁迫诱导灵芝酸生物合成中的作用。
核心内容
该研究以灵芝为对象，探究热胁迫下磷脂酸（PA）调控灵芝酸生物合成的分子机制。通过蛋白质组学筛选结合pull-down与免疫共沉淀，首次鉴定出PA直接结合mTOR的FRB结构域；热胁迫显著增强二者互作，使p-S6K/S6K比值升高约2.35倍，激活mTOR信号。利用药理学抑制剂和基因沉默证实，PLD产生的PA经mTOR促进SREBP加工为核形式（热胁迫30分钟N-SREBP升高1.95倍），核SREBP通过直接结合hmgs、mk、sqs和lss启动子激活灵芝酸合成基因转录，最终使总灵芝酸含量增加约1.89倍。沉默pld、mTOR或SREBP均显著削弱上述激活效应，且外源PA仅能回补PLD上游阻断，不能绕过mTOR或SREBP。该工作首次在丝状真菌中确立PLD-PA-mTOR-SREBP完整信号级联，揭示了热胁迫感知磷脂信号进而调控次级代谢的新机制，为灵芝酸高产工程改造提供了靶点。
创新点
['首次在丝状真菌灵芝中鉴定出PA直接结合mTOR，且结合位点为FRB结构域', '证明热胁迫促进PA与mTOR结合并激活mTOR信号通路', '揭示mTOR通过调控SREBP加工来促进灵芝酸生物合成，建立了PLD-PA-mTOR-SREBP的完整信号级联']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ganoderma lingzhi | 灵芝酸生物合成 | — | — | 调控 | 模式生物，热胁迫诱导灵芝酸积累 |
| Ganoderma lingzhi | 磷脂信号 | pld | PLD | 催化 | 催化磷脂水解产生磷脂酸(PA) |
| Ganoderma lingzhi | mTOR信号通路 | mTOR (g1849) | mTOR | 调控 | PA直接结合其FRB结构域并激活；丝氨酸/苏氨酸激酶 |
| Ganoderma lingzhi | 甾醇调控 | SREBP | SREBP | 调控 | 转录因子，受mTOR调控加工为核形式 |
| Ganoderma lingzhi | 甲羟戊酸途径 | hmgs (g1941) | HMGS | 催化 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶，SREBP直接靶标 |
| Ganoderma lingzhi | 甲羟戊酸途径 | mk (g3941) | MK | 催化 | 甲羟戊酸激酶，SREBP直接靶标 |
| Ganoderma lingzhi | 灵芝酸生物合成 | sqs (g1847) | SQS | 催化 | 鲨烯合酶，SREBP直接靶标 |
| Ganoderma lingzhi | 灵芝酸生物合成 | lss (g1881) | LSS | 催化 | 羊毛甾醇合酶，SREBP直接靶标 |
| Ganoderma lingzhi | mTOR信号通路 | — | S6K | 调控 | mTOR下游效应因子，磷酸化水平反映mTOR活性 |
关键发现
- ['通过PA beads pull-down筛选到20个潜在PA结合蛋白，其中g1849被鉴定为mTOR，含2388个氨基酸，分子量约270.8 kDa', 'mTOR的FRB结构域（1859-1965氨基酸）介导与PA的结合
- 热胁迫显著增加PA-mTOR共沉淀量，而雷帕霉素预孵育使总PA含量显著降低约77.8%（P<0.05）', '热胁迫30 min使p-S6K/S6K比值增加约2.35倍
- 1-丁醇或雷帕霉素抑制此激活，外源PA可逆转1-丁醇的抑制但不能逆转雷帕霉素的抑制', 'pld沉默株SiPLD#1、SiPLD#2、SiPLD#3在热胁迫下p-S6K/S6K比值分别比SiControl降低约57.47%、54.89%、52.59%，外源PA可恢复', '热胁迫使总GA含量增加约1.89倍（P<0.05）
- 1-丁醇和雷帕霉素抑制此增加，外源PA可恢复1-丁醇效应但不能恢复雷帕霉素效应', '热胁迫诱导核形式SREBP（N-SREBP）水平在20和30 min分别增加约1.61和1.95倍（P<0.01）
- 1-丁醇或雷帕霉素预处理可阻断该增加，PA仅能恢复1-丁醇的阻断效应', 'SREBP沉默株中热胁迫诱导的总GA、羊毛甾醇和GA-C2增加幅度分别约为1.43倍、1.79倍和2.11倍，显著低于SiControl株的2.08倍、1.93倍和3.00倍
- 外源PA不能逆转SREBP沉默的效应', 'SREBP可直接结合hmgs、mk、sqs和lss基因的启动子（EMSA验证）']
研究结论
在热胁迫下，PLD介导产生的PA直接结合并激活mTOR，活化的mTOR促进SREBP加工为核形式，核形式SREBP上调灵芝酸生物合成关键基因（hmgs、mk、sqs、lss）的转录，从而促进灵芝酸生物合成。该研究揭示了丝状真菌中热胁迫调控次级代谢的新机制。