Efficient synthesis of enantiopure amines from alcohols using resting E. coli cells and ammonia
- 作者
- Joseline A. Houwman, Tanja Knaus, Magda Costa, Francesco G. Mutti
- 杂志
- Green Chemistry（2019）
- DOI
- 10.1039/c9gc01059a
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
将原先依赖纯化酶和外源NAD+的醇胺化氢借位级联（ADH-AmDH）实现在静息大肠杆菌细胞内，避免酶纯化与辅酶补充，同时解决细胞内氧化还原平衡和胺产物毒性对产率的限制。
研究策略
在大肠杆菌中共表达醇脱氢酶（AA-ADH、LBv-ADH）和胺脱氢酶（Ch1-AmDH），通过添加适量葡萄糖维持NAD+/NADH平衡，优化细胞负载、底物浓度、共溶剂等参数，实现从醇到对映纯胺的转化。
研究路线图
核心内容
该研究首次在静息大肠杆菌细胞内实现了醇脱氢酶与胺脱氢酶偶联的氧化还原平衡级联反应，将醇类底物直接转化为对映纯胺。通过在E. coli BL21(DE3)中共表达AA-ADH、LBv-ADH和Ch1-AmDH三种脱氢酶，利用葡萄糖维持细胞内NAD+/NADH循环，避免了纯化酶和外源辅酶添加。研究发现，底物与葡萄糖摩尔比不低于1:0.6、细胞浓度不低于50 mg/mL时转化效率最高，以(S)-2-己醇为底物可获得82±2%的转化率和14.5±0.3 mM的(R)-2-氨基己烷。产物毒性是产率主要限制因素，不同胺产物的最低抑菌浓度差异显著，如4c仅约1.25-2.5 mM而2c约15 mM。添加10%正十六烷共溶剂可将(R)-4c产量从不足1 mM提高至2 mM。克级制备以消旋2a为底物获得约16%分离产率且对映体过量>99%。该体系为醇到手性胺的绿色生物转化提供了无需酶纯化、操作简便且选择性优异的可行方案。
创新点
首次在静息E. coli细胞中实现ADH-AmDH氢借位胺化级联；通过基因构建优化获得三种脱氢酶的平衡表达；利用葡萄糖精确调控细胞内NAD+/NADH平衡；添加正十六烷作为共溶剂缓解胺产物毒性；完成了克级规模制备。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 醇胺化氢借位级联 | aa-adh | AA-ADH | 催化 | 来自Aromatoleum aromaticum的Prelog型醇脱氢酶，催化醇氧化为酮 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 醇胺化氢借位级联 | lbv-adh | LBv-ADH | 催化 | 来自Lactobacillus brevis的anti-Prelog型醇脱氢酶变体，催化醇氧化为酮，用于外消旋醇的动态转化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 醇胺化氢借位级联 | ch1-amdh | Ch1-AmDH | 催化 | 嵌合胺脱氢酶，催化酮的还原胺化生成胺，利用NADH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 糖酵解/有氧呼吸 | — | — | 能量供给 | 外源葡萄糖经细胞内代谢产生NADH，维持NAD+/NADH平衡，驱动还原胺化 |
关键发现
- E. coli (Ch1-AA) 催化(S)-2-己醇（20 mM）转化为(R)-2-氨基己烷，转化率达82±2%，产物浓度14.5±0.3 mM
- 底物与葡萄糖摩尔比≥1:0.6时转化率最高
- 最佳细胞浓度≥50 mg mL⁻¹ cww
- 对于20 mM底物，最大胺生成量约为15 mM，与(R)-2c的MIC值15 mM一致
- 其他底物如(S)-1a至5a在20 mM时转化率分别为12%、82%、<25%、<25%、46%，ee均>99%
- 在5 mM和10 mM底物浓度下，(S)-3a转化率约81%，(S)-4a在5 mM时转化33%
- 加入10%正十六烷共溶剂后，(R)-4c产量从<1 mM提升至2 mM
- rac-2a（20 mM）用E. coli (Ch1-AA-LBv)转化率达64±6%，产胺12.9±1.1 mM
- rac-5a转化率仅21±6%
- 胺产物毒性明显，如4c的MIC低至约1.25-2.5 mM，2c的MIC约15 mM
- 克级制备以rac-2a（511 mg, 5 mmol）为底物，获得40%转化率，分离产率约16%，ee>99%。
研究结论
本研究证明ADH-AmDH氢借位胺化级联可在静息E. coli细胞中有效运行，以氨和催化量NAD+为代价，无需酶纯化和外源辅酶，实现醇到对映纯胺的转化；系统受胺产物毒性限制，通过共溶剂和优化参数可部分缓解，该体系是绿色、高效、选择性醇胺化生物催化的重要进展。