Exploration of the Mechanisms of Differential Indole Alkaliod Biosynthesis in Dedifferentiated and Cambial Meristematic Cells of Catharanthus roseus Using Transcriptome Sequencing
- 作者
- Pengfei Zhou, Mingxiang Chen
- 单位
- School of Basic Medical Science, Guangdong Medical University, Dongguan, China; School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan, China
- 杂志
- Frontiers in Genetics（2022）
- DOI
- 10.3389/fgene.2022.867064
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）相比脱分化细胞（DDCs）具有更高萜类吲哚生物碱（TIA）产量的分子机制，利用转录组测序鉴定关键差异表达基因及调控网络。
研究策略
建立CMCs和DDCs悬浮细胞培养体系，通过HPLC测定总生物碱、文多灵、长春质碱、阿吗碱和长春花碱含量；利用Illumina HiSeq对两种细胞进行转录组测序，分析差异表达基因并进行KEGG/GO富集，重点解析吲哚生物碱生物合成途径、植物激素信号转导和MAPK信号通路；通过qRT-PCR验证关键基因表达。
核心内容
该研究以长春花形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs）为对象，结合代谢物定量与转录组测序，系统解析了两种细胞在萜类吲哚生物碱（TIA）积累上的差异机制。通过HPLC测定发现，CMCs总生物碱含量达43.72 mg/g，远超DDCs的2.59 mg/L，其中长春质碱和阿吗碱含量分别为DDCs的18.77倍和182.57倍，文多灵与长春花碱仅在CMCs中检出。转录组测序共获得28.02 Gb数据，注释96,004个unigenes，鉴定出9,564个差异表达基因，富集于137个KEGG通路，涉及吲哚生物碱合成、色氨酸代谢及单萜生物合成等途径。进一步分析发现529个转录因子差异表达，多个AP2/ERF、bHLH和MYB家族成员在CMCs中特异或高表达；qRT-PCR验证了TDC、G10H、SGD、D4H等12个关键合成基因中除STR外均在CMCs中上调。研究还整合了植物激素信号转导与MAPK通路的变化，提出CMCs通过多层调控实现TIA高产的机制。该结果为利用CMCs作为高效TIA生产平台及后续代谢工程改造提供了明确靶点。
创新点
['首次系统比较长春花CMCs与DDCs的转录组，揭示差异表达基因及代谢通路', '发现CMCs能同时积累较高含量的文多灵、长春质碱、阿吗碱和长春花碱，其中文多灵和长春花碱仅在CMCs中检出', '整合植物激素信号转导与MAPK信号通路，提出CMCs高产TIAs的多层次调控机制']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 色氨酸代谢/吲哚生物碱生物合成 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化L-色氨酸脱羧为色胺，在CMCs中表达高于DDCs |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 单萜生物合成 | GES | 香叶醇合酶 | 催化 | 催化香叶基二磷酸生成香叶醇，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 单萜生物合成 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 | 催化 | 催化香叶醇10位羟基化，是TIA生物合成的关键限速酶，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 单萜生物合成 | IRS | 环烯醚萜合酶 | 催化 | 参与环烯醚萜骨架合成，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 单萜生物合成 | LAMT | 马钱苷酸甲基转移酶 | 催化 | 催化马钱苷酸甲基化，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 吲哚生物碱生物合成 | STR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化狭叶番泻苷和色胺缩合为异胡豆苷，两个转录本（Cluster-11739.14165和Cluster-11739.372）在CMCs中高表达 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 吲哚生物碱生物合成 | SGD | 异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶 | 催化 | 催化异胡豆苷水解产生活性醛基中间体，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 吲哚生物碱生物合成 | D4H | 脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶 | 催化 | 参与文多灵生物合成，CMCs中表达较高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 吲哚生物碱生物合成 | DAT | 脱乙酰文多灵4-O-乙酰转移酶 | 催化 | 催化文多灵生物合成最后步骤，5个DAT转录本在CMCs中特异或高表达 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 植物激素信号转导 | MYC2 | MYC2转录因子 | 调控 | 茉莉酸信号通路核心转录因子，调控TIA生物合成基因，多个MYC2在CMCs中表达更高 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | MAPK信号通路 | MMK3 | 丝裂原活化蛋白激酶激酶3 | 调控 | 参与茉莉酸信号调控TIA生物合成，三个MMK3转录本在CMCs中高表达 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 生物碱转运 | ABC转运蛋白（B亚家族） | ATP结合盒转运蛋白B亚家族 | 转运 | 介导植物激素和生物碱转运，B亚家族成员在CMCs中高表达，有利于生物碱积累 |
| 长春花（Catharanthus roseus）形成层分生细胞（CMCs）和脱分化细胞（DDCs） | 生物碱转运 | Ca2+/H+反向转运蛋白 | 钙氢反向转运蛋白 | 转运 | 介导质子驱动的液泡生物碱转运，多个成员在CMCs和DDCs中差异表达 |
关键发现
['CMCs中总生物碱含量为43.72 mg/g，而DDCs仅为2.59 mg/L', 'CMCs中长春质碱含量是DDCs的18.77倍，阿吗碱含量是DDCs的182.57倍', '文多灵和长春花碱仅在CMCs中检测到，DDCs中未检出', '转录组测序获得28.02 Gb clean data，Q30≥93%，共注释96,004个unigenes，鉴定出9,564个差异表达基因（DEGs）', 'DEGs富集于137个KEGG通路，其中3,713个基因在CMCs中上调，5,851个下调', '吲哚生物碱生物合成、色氨酸代谢、单萜生物合成和萜类骨架生物合成等通路存在显著差异表达', '529个转录因子和162个转录调控因子差异表达，其中多个AP2/ERF、bHLH、MYB相关TF在CMCs中特异或高表达', 'qRT-PCR证实TDC、G10H、IRS、LMAT、SGD、D4H、GES、ORCA3等12个关键基因中除STR外均在CMCs中更高表达']
研究结论
长春花CMCs相比DDCs能够积累显著更高水平的多种萜类吲哚生物碱，是更优的TIA生产平台。转录组分析揭示了吲哚生物碱生物合成及其上游代谢途径、植物激素信号转导和MAPK信号通路中的关键差异表达基因与转录因子，为工程化改造CMCs实现大规模TIA生产提供了候选靶点。