高级醇 · 代谢工程文献库

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Characterization of a New Saccharomyces cerevisiae Isolated From Hibiscus Flower and Its Mutant With L-Leucine Accumulation for Awamori Brewing

作者
Takayuki Abe, Yoichi Toyokawa, Yukiko Sugimoto, Haruna Azuma, Keiko Tsukahara, Ryo Nasuno, Daisuke Watanabe, Masatoshi Tsukahara, Hiroshi Takagi
单位
BioJet Co., Ltd., Okinawa, Japan; Division of Biological Science, Graduate School of Science and Technology, Nara Institute of Science and Technology, Ikoma, Japan
杂志
Frontiers in Genetics（2019）
DOI
10.3389/fgene.2019.00490
所属领域
发酵工程
关键词
Saccharomyces cerevisiaeawamoribreedingcomparative genomicshibiscus yeastliquor flavors
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解决的核心问题

开发适合泡盛酒（awamori）酿造的新型酵母菌株，以增强初期果香（异戊醇和异戊乙酸酯）和陈酿甜香（4-乙烯基愈创木酚/香兰素）的风味特征

研究策略

从冲绳木槿花中分离天然酵母菌株，进行全基因组测序和系统发育分析，并通过化学诱变（EMS）结合5,5,5-三氟-DL-亮氨酸（TFL）抗性筛选获得L-亮氨酸积累突变株，靶向L-亮氨酸合成途径进行菌株育种

研究路线图

100%
问题：泡盛酒缺乏果香与甜香风味
策略：从木槿花中筛选新型酿酒酵母
验证：全基因组测序与系统发育分析
改造：EMS诱变+TFL抗性筛选LEU4突变株
机制：IPMS对反馈抑制脱敏（Gly516Ser）
结果：PAD1/FDC1完整，4-VG产量提高3倍
结果：T25胞内L-亮氨酸积累，异戊醇/异戊乙酸酯提高2.3倍
结论：HC02-5-2及T25兼具果香与甜香，适合泡盛酒酿造
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核心内容

该研究从冲绳木槿花中分离到一株与葡萄酒酵母亲缘关系相近的酿酒酵母新菌株HC02-5-2，并针对泡盛酒酿造中初期果香和陈酿甜香不足的问题进行菌株育种。HC02-5-2携带完整的PAD1和FDC1基因，能高效合成4-乙烯基愈创木酚，产量达6.47 μg/ml，约为传统泡盛酒酵母101-18的3倍，且乙醇浓度达18.75%，优于常规菌株。随后通过EMS化学诱变结合TFL抗性筛选，获得L-亮氨酸积累突变株T25，其LEU4基因的G1546A杂合突变导致Gly516Ser替换，使异丙基苹果酸合酶对L-亮氨酸反馈抑制脱敏，胞内L-亮氨酸含量由0.066%升至0.225%，而缬氨酸和异亮氨酸相应下降。在10 mM亮氨酸存在下，T25的酶活性仍保持约80%，野生型则被显著抑制。用T25酿造的泡盛酒中异戊醇和异戊乙酸酯浓度较亲本提高2.3倍。该研究证明，结合天然菌株筛选与代谢靶向诱变可同时增强泡盛酒初期的花果香与陈酿甜香，为风味定向酿酒酵母育种提供了有效策略。

创新点

首次从木槿花中分离到与葡萄酒酵母亲缘关系相近的酿酒酵母新菌株HC02-5-2；该菌株携带完整的PAD1和FDC1基因，能高效产生4-VG（传统泡盛酒酵母101-18因FDC1假基因不产4-VG）；通过诱变获得LEU4 Gly516Ser突变，使IPMS对L-亮氨酸反馈抑制脱敏，从而积累L-亮氨酸并提高异戊醇和异戊乙酸酯产量

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae HC02-5-2 苯丙烯酸脱羧途径（4-乙烯基愈创木酚合成） PAD1, FDC1 Pad1p, Fdc1p（苯丙烯酸脱羧酶） 催化 HC02-5-2具有完整的PAD1和FDC1基因，能将阿魏酸脱羧为4-VG；传统泡盛酒酵母101-18因FDC1无义突变不能产生4-VG
Saccharomyces cerevisiae T25（HC02-5-2的EMS突变株） L-亮氨酸生物合成途径 LEU4 α-异丙基苹果酸合酶（IPMS） 催化 LEU4基因Gly516Ser杂合突变降低IPMS对L-亮氨酸反馈抑制的敏感性，导致胞内L-亮氨酸积累，进而促进异戊醇和异戊乙酸酯合成
Saccharomyces cerevisiae HC02-5-2 异戊醇/异戊乙酸酯合成途径 ATF1 醇乙酰转移酶 催化 ATF1编码醇乙酰转移酶，将异戊醇转化为异戊乙酸酯；T25菌株中异戊醇和异戊乙酸酯产量较亲本提高2.3倍
Saccharomyces cerevisiae 101-18 苯丙烯酸脱羧途径 FDC1 Fdc1p（苯丙烯酸脱羧酶） 催化 常规泡盛酒酵母，FDC1为假基因，因无义突变失去4-VG产生能力，作为对照菌株

关键发现

  1. HC02-5-2菌株在实验室发酵中乙醇浓度达18.75%，高于常规菌株101-18的17.71%
  2. HC02-5-2的4-VG产量为6.47 μg/ml，约为101-18（1.99 μg/ml）的3倍
  3. 突变株T25胞内L-亮氨酸含量为0.225±0.033%（干重），亲本为0.066±0.006%（干重），且L-缬氨酸和L-异亮氨酸分别降至约30%和70%
  4. 在10 mM L-亮氨酸存在下，T25的IPMS活性保持约80%，而野生型被显著抑制
  5. T25酿造的泡盛酒中异戊醇和异戊乙酸酯浓度比HC02-5-2高2.3倍
  6. LEU4基因存在G1546A杂合突变导致Gly516Ser氨基酸替换

研究结论

新分离的木槿花酵母HC02-5-2及其L-亮氨酸积累突变株T25同时具备促进初期果香和老化甜香风味的能力，适用于泡盛酒酿造；结合天然菌株分离、全基因组分析与代谢靶向育种的方法有助于丰富酒精饮料的风味多样性