Biological Methods for Studying the Biosynthesis of Natural Products
- 作者
- C. R. Hutchinson
- 单位
- School of Pharmacy and Department of Bacteriology, University of Wisconsin, 425 N. Charter Street, Madison, WI 53706, USA
- 杂志
- Natural Product Reports（1986）
- DOI
- 10.1039/np9860300133
- 所属领域
- 天然产物生物合成/代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
综述研究天然产物生物合成的生物学方法，包括完整细胞研究、酶学分析和遗传学方法，以阐明次级代谢途径的调控机制和酶催化机理。
研究策略
从完整细胞（原生质体、抑制剂、营养调控、自调节因子）、酶学（多个实例：黄曲霉毒素、生物碱、蒽醌、抗生素、黄酮、萜类）以及遗传学（突变、重组、基因克隆）三个层面系统介绍研究方法，并结合基因工程实例展示杂合抗生素的创制。
核心内容
该文系统综述了1980年代研究天然产物生物合成的三类生物学方法。在完整细胞层面，利用原生质体、代谢抑制剂、营养调控及微生物自身调节因子（如A-因子）等手段解析途径的诱导与调控机制，发现A-因子在皮摩尔浓度即可触发链霉菌分化并启动抗生素产生。酶学层面，从长春花细胞培养物中将严格苷合成酶纯化约50倍并确定其Km值；将dihydrogeodin oxidase纯化至均一，证实其含16个铜原子且每生成1 mol (+)-geodin消耗0.5 mol O2；异青霉素N合酶被纯化至均一，分子量约41 kDa；泰乐菌素途径的macrocin O-甲基转移酶为含33 kDa与65 kDa亚基的二聚体，对SAM和macrocin的Km分别为64和24 μmol/dm3。遗传学层面，通过突变、重组及基因克隆，将来自Streptomyces erythraeus约35 kb的DNA片段导入变铅青链霉菌后成功产生红霉素A，并利用抗性基因等标记探针克隆大片段DNA，实现了二氢花岗岩红菌素等真正杂合抗生素的定向创制。该综述表明，重组DNA技术将大幅加速天然产物生物合成机制解析，并为代谢工程改造次级代谢途径提供全新策略。
创新点
系统总结了重组DNA方法在该领域中的应用前景；通过克隆和转移抗生素生物合成基因簇（如act基因簇）实现了真正意义上的杂合抗生素（二氢花岗岩红菌素、麦德红菌素A）的合成；利用标记基因（如抗性基因）作为探针克隆大片段DNA。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 单萜吲哚生物碱生物合成 | — | strictosidine synthase（严格苷合成酶） | 催化 | 从长春花组织培养物中纯化约50倍至近均一，固定化后热稳定性显著提高，可用于大量合成严格苷。 |
| Eschscholzia tenuifolia | 苄基异喹啉生物碱生物合成 | — | (S)-norlaudanosoline synthase | 催化 | 纯化约40倍，存在四种同工酶，可被PAGE区分。 |
| Aspergillus terreus | geodin生物合成（蒽醌/聚酮途径） | — | emodin 1-O-methyltransferase | 催化 | 通过蓝Sepharose和Sepharose 6B两步层析纯化89倍，对底物大黄素具有严格特异性。 |
| Aspergillus terreus | geodin生物合成 | — | dihydrogeodin oxidase | 催化 | 纯化至均一，含16个铜原子，每生成1 mol (+)-geodin消耗0.5 mol O2，是首个纯化的酚类氧化偶联酶。 |
| Streptomyces antibioticus | 放线菌素D生物合成 | — | phenoxazinone synthase | 催化 | 存在大（799-919 kDa）和小（237 kDa）两种形式，均由97 kDa亚基组成；催化放线菌素酮合成，每生成1 mol产物消耗1.5 mol O2。 |
| Streptomyces griseus | 链霉素生物合成 | — | dTDP-L-dihydrostreptose synthase | 催化 | 纯化50倍；利用E. coli Y-10突变株提供dTDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖等底物。 |
| Streptomyces griseus | 链霉素生物合成 | — | O-α-L-dihydrostreptosyl-(1→4)-streptidine 6-磷酸合成酶（糖基转移酶） | 催化 | 分子量63 kDa（两个35 kDa亚基），需Mn2+或Mg2+；通过链啶6-磷酸亲和层析纯化至近均一。 |
| Cephalosporium acremonium | β-内酰胺抗生素生物合成 | — | isopenicillin N synthetase | 催化 | 纯化至均一，Mr≈41 kDa；能够催化形成多种β-内酰胺结构，对底物三肽具有较宽特异性。 |
| Streptomyces erythraeus | 红霉素生物合成 | — | 6-deoxyerythronolide B hydroxylase（含细胞色素P-448） | 催化 | 纯化至均一，工业菌株中含量约比野生型高5倍；可能有多种形式。 |
| Streptomyces fradiae | 泰乐菌素生物合成 | — | macrocin O-methyltransferase | 催化 | pI 4.5，由33 kDa和65 kDa两个亚基组成；对SAM和macrocin的Km分别为64和24 μmol/dm3，遵循有序Bi Bi机制。 |
| Petroselinum hortense | 类黄酮生物合成 | — | naringenin-chalcone synthase | 催化 | 由两个42 kDa亚基组成，不含泛酰巯基乙胺；在特定条件下可催化生成少两个碳单位的产物。 |
| Salvia officinalis | 单萜生物合成 | — | geranyl pyrophosphate:pinene cyclases I和II | 催化 | 部分纯化后证明单一环化酶可催化产生多种立体相关单萜产物。 |
| Streptomyces griseus | 细胞分化/次级代谢调控 | — | C-factor（蛋白） | 调控 | 分子量约34.5 kDa，刺激S. griseus突变株的细胞分化。 |
| Streptomyces griseus | 叶酸生物合成（对氨基苯甲酸） | pab | — | 催化 | 克隆的4.5 kb DNA片段可互补E. coli pabA和pabB突变，并赋予磺胺抗性；可能在合成多烯大环内酯抗生素candidicin中提供p-氨基苯乙酮部分。 |
| Streptomyces violaceoruber Tu22 | 异色醌类抗生素生物合成（actinorhodin/granaticin） | act基因簇 | — | 催化 | 导入来源于S. coelicolor的act基因簇后，产生二氢花岗岩红菌素（dihydrogranatirhodin），几乎完全取代正常抗生素。 |
| Streptomyces sp. AM-7161 | 异色醌类抗生素生物合成（medermycin/actinorhodin） | act基因簇（部分克隆） | — | 催化 | 部分act基因簇导入后产生麦德红菌素A（mederrhodin A），即麦德霉素C-8位羟基化衍生物。 |
关键发现
- A-因子在皮摩尔浓度即诱导链霉菌分化并产生抗生素
- C-因子分子量约34.5 kDa，刺激细胞分化。严格苷合酶从长春花细胞培养物中纯化约50倍，Km值及pH最适值已确定
- dihydrogeodin oxidase纯化至均一，含16个铜原子，每生成1 mol (+)-geodin消耗0.5 mol O2
- 异青霉素N合酶从顶头孢霉等纯化至均一，Mr≈41 kDa
- 6-脱氧红霉内酯B羟化酶含细胞色素P-448，工业菌株中的含量比野生型高约5倍
- 泰乐菌素途径的macrocin O-甲基转移酶pI 4.5，由33 kDa和65 kDa亚基组成，对SAM和macrocin的Km分别为64和24 μmol/dm3
- 柚皮素查尔酮合酶为两个42 kDa亚基，不含泛酰巯基乙胺
- 从Streptomyces erythraeus克隆的约35 kb DNA片段导入S. lividans后，可使其产生红霉素A
- 携带12.4 kb tetracenomycin C DNA片段的质粒转化链霉菌后大量产生红色素(54)和(55)。
研究结论
酶学研究已获得丰硕成果，基因克隆等重组DNA技术将极大加速天然产物生物合成的研究，并可通过基因工程定向创造新的杂合抗生素。