Crystal structure and functional analysis of large-terpene synthase belonging to a newly found subclass
- 作者
- Masahiro Fujihashi, Tsutomu Sato, Yuma Tanaka, Daisuke Yamamoto, Tomoyuki Nishi, Daijiro Ueda, Mizuki Murakami, Yoko Yasuno, Ai Sekihara, Kazuma Fuku, Tetsuro Shinada, Kunio Miki
- 杂志
- Chemical Science（2018）
- DOI
- 10.1039/C8SC00289D
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
自然界中已发现数千种萜烯，但已知的萜烯合酶仅有两类（Class I和Class II），它们具有特征性氨基酸基序。本研究新发现一类不含已知基序的大型萜烯（C25/C30/C35）合酶，需要阐明其分子机制并确定其分类。
研究策略
从Bacillus alcalophilus中克隆并异源表达BalTS，利用硒代甲硫氨酸衍生物通过单波长反常散射法解析其晶体结构（1.64 Å）。结合生化活性分析、定点突变、产物GC-MS分析和结构比对，提出新的萜烯合酶亚类Class IB。
核心内容
本研究从嗜碱芽孢杆菌中克隆并异源表达了大型萜烯合酶BalTS，利用硒代甲硫氨酸衍生物通过单波长反常散射法解析了其1.64 Å高分辨率晶体结构，这是首次获得大型萜烯合酶的三维结构。生化活性分析表明BalTS可催化C25/C30/C35头尾型前体生成相应β-萜烯产物，且胞内天然检测到部分产物。通过定点突变发现两个新型天冬氨酸富集基序DYLDNxD和DY(F,L,W)IDxxED中的任一关键天冬氨酸突变都会完全消除酶活性，去除镁离子同样导致活性丧失，证明二者对催化不可或缺。序列比对显示BsuTS与BalTS同一性达49%，对BsuTS进行C-端截短突变后发现环化产物产量随截短程度逐步降低而线性产物基本不受影响，提示16残基的C-端延伸覆盖底物结合腔并调控环化反应。据此提出并定义了萜烯合酶新亚类Class IB，该类酶广泛分布于厚壁菌门、变形菌门和蓝细菌中，拓展了对萜烯合酶结构多样性和催化机制的认识，也为挖掘新型天然产物提供了新的分子标记与筛选靶点。
创新点
首次解析大型萜烯合酶的晶体结构；发现两个新型天冬氨酸富集基序DYLDNxD和DY(F,L,W)IDxxED；提出并定义萜烯合酶新亚类Class IB；通过BsuTS的C-端截短突变揭示了C-端延伸对环化反应的关键作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus alcalophilus | 大型萜烯生物合成 | — | BalTS | 催化 | 新型Class IB萜烯合酶，本研究解析其晶体结构并分析功能 |
| Bacillus subtilis | 大型萜烯生物合成 | — | BsuTS | 催化 | 同源酶，用于C-端截短突变分析环化机制 |
| Bacillus clausii | 大型萜烯生物合成 | — | BclTS | 催化 | 同源酶，催化底物2-4生成β-prenses（7-9） |
关键发现
- 解析了BalTS的晶体结构，分辨率达1.64 Å
- BalTS催化C25/C30/C35头尾型前体（1-4）生成相应β-prenses（6-9），且B. alcalophilus细胞内天然产生7-9
- 两个新基序DYLDNxD和DY(F,L,W)IDxxED中任一天冬氨酸突变均完全消除酶活性，去除Mg2+同样导致活性丧失
- BsuTS与BalTS氨基酸序列同一性为49%（e值2e-130）
- BsuTS的C-端截短突变（K349ter、F350ter、Q351ter、K352ter、M353ter）导致环化产物5的产量随截短程度降低，而线性产物9的产量基本不变
- BsuTS具有16残基的C-端延伸，BalTS没有，推测该延伸覆盖底物结合腔并影响环化。
研究结论
本研究定义了一类新的萜烯合酶亚类Class IB，它们负责大型头尾型萜烯的生物合成，广泛分布于多种细菌（包括firmicutes、proteobacteria和cyanobacteria）。两个特征性天冬氨酸富集基序可作为该类的标志。该发现扩展了萜烯合酶的结构与功能认识，为发现新的天然产物和化学基因组学研究提供了基础。