Cell-Free Biosynthesis of Precursors of Polyprenyl Derivatives of p-Hydroxybenzoate in Mammalian and Bacterial Systems
- 作者
- HARRY RUDNEY
- 单位
- Department of Biological Chemistry, University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio 45229, U.S.A.
- 杂志
- Biochemical Journal（1972）
- DOI
- 10.1042/bj1280013p
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究哺乳动物和细菌中泛醌前体（p-羟基苯甲酸的多异戊烯基衍生物）的细胞游离生物合成途径及关键酶的特性。
研究策略
采用细胞游离（无细胞）体系，通过补充异戊烯基焦磷酸或甲羟戊酸与ATP，结合同位素标记、离心分级和酶抑制处理，分析多异戊烯基-p-羟基苯甲酸的形成条件及侧链构型。
核心内容
本研究建立了哺乳动物（大鼠肝脏）与细菌来源的细胞游离合成体系，用于解析泛醌前体——p-羟基苯甲酸多异戊烯基衍生物的生物合成机制。在大鼠肝48000g上清液中，以甲羟戊酸和ATP为底物即可生成多异戊烯基-p-羟基苯甲酸，证明该过程不依赖细菌提取物；线粒体部分具有几乎与上清液同等活跃的异戊烯基焦磷酸异构酶活性，且线粒体内膜含有相应的转移酶。研究还发现多异戊烯基焦磷酸必须与蛋白质结合才具备底物活性，胰蛋白酶处理会使转移酶活性完全丧失，提示酶-底物复合物在催化中起关键作用。利用[3R,4R-3H]甲羟戊酸立体标记，证实侧链为反式构型。这些结果确立了哺乳动物细胞游离合成多异戊烯基-p-羟基苯甲酸的条件，揭示了线粒体酶系及蛋白结合型异戊烯基焦磷酸的必要性，为理解泛醌生物合成途径提供了关键酶学与立体化学依据。
创新点
首次在大鼠肝细胞游离体系中不依赖细菌提取物即可合成多异戊烯基-p-羟基苯甲酸；证明线粒体内膜含该转移酶；发现多异戊烯基焦磷酸需与蛋白质结合才具活性；利用立体标记证明侧链为反式构型。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大鼠肝 | 泛醌生物合成 | — | p-羟基苯甲酸多异戊烯基转移酶 | 催化 | 位于线粒体内膜 |
| 大鼠肝 | 泛醌生物合成 | — | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 线粒体中活性几乎与48000g上清液相当 |
| 藤黄微球菌 (Micrococcus lysodeikticus) | 泛醌生物合成 | — | 多异戊烯基焦磷酸合成酶 | 催化 | 用于合成多异戊烯基焦磷酸侧链 |
| 红螺菌 (Rhodospirillum rubrum) | 泛醌生物合成 | — | 多异戊烯基转移酶与脱羧酶 | 催化 | 硫酸铵分级可分离转移酶和脱羧酶 |
关键发现
- 建立了哺乳动物（大鼠肝脏）细胞游离合成体系，在48000g上清液中以甲羟戊酸和ATP为底物可生成多异戊烯基-p-羟基苯甲酸
- 线粒体具有几乎与48000g上清液同样活跃的异戊烯基焦磷酸异构酶
- 多异戊烯基焦磷酸必须与蛋白结合才具有底物活性，胰蛋白酶处理导致转移酶活性完全丧失
- 利用[3R,4R-3H]甲羟戊酸标记证明侧链为反式构型。
研究结论
研究结论：建立了哺乳动物来源的细胞游离体系合成多异戊烯基-p-羟基苯甲酸的条件，揭示了线粒体酶系及蛋白结合型异戊烯基焦磷酸在该反应中的必要性，并证实侧链为反式构型，为深入理解泛醌生物合成提供了依据。