高级醇 · 代谢工程文献库

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Molecular cloning, expression profiling and functional analyses of a cDNA encoding isopentenyldiphosphate isomerase from Gossypium barbadense

作者
Yechun WANG, Chengxiang QIU, Fei ZHANG, Binhui GUO, Zhiqi MIAO, Xiaofen SUN, Kexuan TANG
单位
Plant Biotechnology Research Center, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University; State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Morgan-Tan International Center for Life Sciences, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, Fudan University
杂志
Bioscience Reports（2008）
DOI
10.1042/BSR20070052
所属领域
代谢工程
关键词
Gossypium barbadenseVerticillium dahliae Klebisopentenyldiphosphate (IPP) isomerase (IPI)isoprenoid biosynthetic pathwayrapid amplification of cDNA ends (RACE)sesquiterpene phytolaxin
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解决的核心问题

棉花中IPP异构酶基因未被克隆，其表达调控及功能尚不清楚，本研究旨在从海岛棉中克隆GbIPI基因并验证其功能。

研究策略

利用RACE技术克隆GbIPI全长cDNA，通过序列分析、Southern blot和半定量RT-PCR研究其家族与表达模式，并利用大肠杆菌异源表达系统通过β-胡萝卜素积累实验验证其催化功能。

研究路线图

100%
1. 问题：海岛棉GbIPI基因未被克隆，功能未知
2. 策略：RACE克隆+cDNA全长获取
3. 关键改造：序列分析+家族鉴定+表达检测
4. 关键改造：大肠杆菌共表达体系构建
5. 结果：GbIPI隶属I型IPI家族，茎中高表达，受防御信号诱导
6. 结果：β-胡萝卜素产量达2.03 mg/L（对照1.05），提升3倍
7. 结论：GbIPI是功能性的IPP异构酶，参与棉花萜类防御代谢
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核心内容

本研究从海岛棉中首次克隆了异戊烯基二磷酸异构酶基因GbIPI。通过RACE技术获得全长cDNA，序列分析显示其包含906 bp开放阅读框，编码302个氨基酸，预测蛋白分子量34.39 kDa，等电点6.07，属于I型IPI家族，与多种植物同源蛋白高度相似。Southern blot分析表明GbIPI属于小基因家族。半定量RT-PCR显示该基因在茎中表达最高，叶次之，根最低，且受黄萎病菌、茉莉酸甲酯和水杨酸诱导，分别在处理后24小时、12小时和24小时达到峰值。将GbIPI与pAC-BETA质粒共转化大肠杆菌TOP10 F'进行功能验证，β-胡萝卜素产量达3.19 mg/l，约为对照的3倍，证实该基因编码功能性IPP异构酶并能显著增强类胡萝卜素合成通量。该结果说明GbIPI在棉花异戊二烯代谢中发挥关键催化作用，且受防御信号调控，可能参与棉花萜类植保素合成及抗病防御反应。

创新点

首次从棉花（海岛棉）中克隆了IPP异构酶基因GbIPI，并证明其能显著提高大肠杆菌中β-胡萝卜素的积累，为研究棉花萜类防御代谢提供了分子基础。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Gossypium barbadense 异戊二烯生物合成途径（MVA/MEP） GbIPI 异戊烯基二磷酸异构酶（IPP isomerase, IPI） 催化 催化IPP与DMAPP之间的异构化，是萜类生物合成的关键步骤
Escherichia coli TOP10 F' β-胡萝卜素合成途径（借助pAC-BETA质粒） crtE, crtB, crtI, crtY GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱饱和酶、番茄红素环化酶 催化 pAC-BETA质粒携带的异源基因，用于功能性验证GbIPI活性

关键发现

  1. 成功克隆了海岛棉IPP异构酶基因GbIPI，其cDNA全长1205 bp，包含906 bp ORF，编码302个氨基酸，预测分子量34.39 kDa，等电点6.07。GbIPI属于I型IPI家族，与多种植物IPI具有高同源性。Southern blot显示GbIPI属于小基因家族。表达分析表明GbIPI在茎中表达最高，叶次之，根最低
  2. 受黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）诱导，分别在处理后24 h、12 h和24 h达到最高表达水平。功能验证表明，共表达GbIPI和pAC-BETA的大肠杆菌TOP10 F'中β-胡萝卜素产量达3.19 mg/l，约为对照（1.05 mg/l）的3倍，证实GbIPI编码有功能的IPP异构酶并能促进类胡萝卜素合成途径通量。

研究结论

本研究首次从海岛棉中克隆并鉴定了编码IPP异构酶的功能基因GbIPI，该基因在异戊二烯生物合成途径中起关键催化作用，并受防御信号诱导表达，可能在棉花对病害的防御反应及萜类植保素（如棉酚）合成中发挥重要作用。