Transcriptome Analysis of Taxus cuspidata Needles Based on 454 Pyrosequencing
- 作者
- Qiong Wu, Chao Sun, Hongmei Luo, Ying Li, Yunyun Niu, Yongzhen Sun, Aiping Lu, Shilin Chen
- 单位
- Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing, P.R. China; Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, P.R. China
- 杂志
- Planta Med（2011）
- DOI
- 10.1055/s-0030-1250331
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成途径尚未完全阐明，Taxus属基因组信息匮乏，缺乏全面的转录组数据以支持紫杉醇生物合成相关基因的发现和调控机制研究。
研究策略
采用454焦磷酸测序技术对Taxus cuspidata针叶cDNA文库进行高通量测序，通过de novo组装、与公共数据库比对进行功能注释，结合KEGG代谢途径分析和SSR标记鉴定，系统挖掘紫杉醇生物合成相关基因、转录因子及分子标记。
核心内容
本研究利用454焦磷酸测序技术对东北红豆杉（Taxus cuspidata）针叶cDNA文库进行高通量测序，旨在系统挖掘紫杉醇生物合成相关基因并丰富该物种的基因组信息资源。通过de novo组装获得81,148条高质量reads，平均长度389 bp，最终组装得到20,557条unique sequences，其中包括7,582个contigs和12,975个singletons，平均长度456.6 bp，构建了当时Taxus属最大的EST数据集。功能注释显示68.6%的unique sequences在公共数据库中有显著匹配，2,403条转录本参与3,821条KEGG生化途径。关键结果是完整鉴定了质体MEP途径全部七个酶基因，其中HDR基因拥有69条EST，DXPS和DXR各23条；紫杉醇生物合成相关基因中taxane 13α-hydroxylase有34条EST。此外还鉴定出291个转录因子同源物和753个SSR基序，SSR密度约每12.47 kb一个。这些数据为阐明紫杉醇生物合成通路、发现新型催化酶基因以及开展分子标记辅助育种提供了重要的序列资源和理论基础。
创新点
首次对Taxus属进行基于新一代测序平台的转录组分析；构建了迄今最大的Taxus EST数据集（20,557条unique sequences）；完整鉴定质体MEP途径全部七个酶基因及多个紫杉醇生物合成候选基因；筛选出291个推测转录因子同源物和753个SSR基序。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径（2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 | 催化 | MEP途径第一个限速酶，15条EST |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 23条EST |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | MCT | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 9条EST |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | CMK | 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | 14条EST |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | MCS | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合成酶 | 催化 | 10条和2条EST，两种同源 |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | HDS | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶 | 催化 | 25条EST |
| Taxus cuspidata | 质体MEP途径 | HDR | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | 69条EST，表达最丰富 |
| Taxus cuspidata | 异戊二烯前体合成 | IDI | 异戊烯基二磷酸δ-异构酶 | 催化 | 6条EST |
| Taxus cuspidata | 萜类前体合成 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 5条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T5OH | 紫杉二烯5α-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 多个contig，共至少18条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | TAT | 紫杉二烯5α-醇O-乙酰转移酶 | 催化 | 1条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T10OH | 紫杉烷10β-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 多个contig，共至少9条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T13OH | 紫杉烷13α-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 34条EST，表达丰富 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T2OH | 紫杉烃2α-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 4条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | TBT | 2α-羟紫杉烷2-O-苯甲酰转移酶 | 催化 | 33条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | DABT | 10-脱乙酰巴卡亭III 10-O-乙酰转移酶 | 催化 | 2条EST |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | DBTNBT | 3'-N-脱苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇N-苯甲酰转移酶 | 催化 | 2条EST |
| Taxus cuspidata | 转录调控 | MYB | MYB转录因子 | 调控 | 推测转录因子同源物之一 |
| Taxus cuspidata | 转录调控 | WRKY | WRKY转录因子 | 调控 | 18条unique sequences |
| Taxus cuspidata | 转录调控 | bHLH | 碱性螺旋-环-螺旋转录因子 | 调控 | 推测转录因子同源物之一 |
| Taxus cuspidata | 转录调控 | NAC | NAC结构域蛋白 | 调控 | 推测转录因子同源物之一 |
关键发现
- 获得81,148条高质量reads，平均长度389 bp，平均质量分数31
- 组装得到20,557条unique sequences（7,582个contigs和12,975个singletons），平均长度456.6 bp。74,209条reads组装成contigs，冗余度92.7%。SwissProt匹配率38.5%，Nr数据库58.7%，拟南芥59.4%，松树59.2%，云杉63.0%
- 14,095条(68.6%)unique sequences在公共数据库中有显著匹配。GO注释显示11,220条(54.6%)分配到45个GO类目。KEGG映射显示2,403条转录本参与3,821条生化途径。质体MEP途径所有七个酶基因均被鉴定，其中HDR有69条EST，DXPS和DXR各23条，IDI 6条，GGPPS 5条。紫杉醇生物合成相关基因中，taxane 13α-hydroxylase有34条EST，taxane 2α-O-benzoyltransferase有33条EST。共鉴定291个转录因子同源物，其中锌指蛋白80个，homeobox 28个，WRKY 18个。753个SSR基序分布于641条unique sequences中，密度约每12.47 kb一个，频率3.1%，88%的SSR长度为14-24 bp
- Sanger验证8个SSR中7个与454结果一致。
研究结论
本研究提供了Taxus属最大的EST集合，全面揭示了T. cuspidata针叶的基因表达谱，鉴定了紫杉醇生物合成途径的关键酶基因、候选基因及大量转录因子和SSR标记，为紫杉醇生物合成通路的完善、新型基因发现及分子育种提供了重要资源。