Identification of Intermediates and Enzymes Involved in the Early Steps of Artemisinin Biosynthesis in Artemisia annua
- 杂志
- Planta Medica（2005）
- DOI
- 10.1055/s-2005-837749
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析青蒿素生物合成途径早期步骤中的中间体和酶，特别是从amorpha-4,11-diene到dihydroartemisinic acid之间的转化途径。
研究策略
通过GC-MS技术分析青蒿叶片和腺毛中的萜类化合物组成，并结合体外酶学实验，鉴定关键中间体的存在及催化其转化的酶活性。
核心内容
该研究通过GC-MS分析和体外酶学实验，系统解析了青蒿中青蒿素生物合成早期步骤的中间体及催化酶。研究在青蒿叶片和腺毛中鉴定出青蒿醇、双氢青蒿醇、青蒿醛和双氢青蒿醛等含氧amorpha-4,11-diene衍生物，并检测到相应的酶活性。青蒿素含量占叶片干重的0.01%-0.8%。酶学实验表明，在NADPH存在下叶片微粒体可将amorpha-4,11-diene羟化为青蒿醇；在NAD+/NADP+存在下，叶片上清可将青蒿醇氧化为青蒿醛、双氢青蒿醛和双氢青蒿酸，而腺毛上清仅产生青蒿醛和双氢青蒿醛。合成实验中，青蒿醇总产率14%，双氢青蒿醇总产率43%，双氢青蒿醛相对醇产率67%（总产率54%），从花中分离获得约2 mg青蒿醛（纯度76%）。此外，双氢青蒿醛可被进一步氧化为双氢青蒿酸，但未检测到青蒿酸还原为双氢青蒿酸的反应。据此提出完整早期途径：amorpha-4,11-diene→青蒿醇→青蒿醛→双氢青蒿醛→双氢青蒿酸→青蒿素，为青蒿素异源合成和产量提升奠定了关键酶学基础。
创新点
首次在青蒿中鉴定了一系列含氧的amorpha-4,11-diene衍生物（青蒿醇、双氢青蒿醇、青蒿醛、双氢青蒿醛）以及相应的酶活性，提出了完整的青蒿素早期生物合成途径。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | — | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FDP环化形成amorpha-4,11-diene，该酶已被克隆并鉴定。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | — | amorpha-4,11-diene hydroxylase (细胞色素P450) | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene羟基化生成artemisinic alcohol，活性存在于微粒体部分，依赖NADPH。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | — | artemisinic alcohol dehydrogenase | 催化 | 催化artemisinic alcohol氧化为artemisinic aldehyde，依赖NAD+/NADP+。 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | — | dihydroartemisinic aldehyde dehydrogenase | 催化 | 催化dihydroartemisinic aldehyde氧化为dihydroartemisinic acid，存在于叶片和腺毛上清。 |
关键发现
- 青蒿素含量占叶片干重的0.01%-0.8%
- 合成青蒿醇总产率14%，双氢青蒿醇总产率43%，双氢青蒿醛相对醇产率67%（总产率54%）
- 从花中分离获得约2 mg青蒿醛（纯度76%）。酶学实验证实：在NADPH存在下，叶片微粒体可将amorpha-4,11-diene羟化为青蒿醇
- 在NAD+/NADP+存在下，叶片上清可将青蒿醇氧化为青蒿醛、双氢青蒿醛和双氢青蒿酸，而腺毛上清仅产生青蒿醛和双氢青蒿醛
- 双氢青蒿醛可在NAD+/NADP+存在下被氧化为双氢青蒿酸
- 未检测到青蒿酸还原为双氢青蒿酸。
研究结论
青蒿素生物合成早期最可能的途径为：amorpha-4,11-diene → artemisinic alcohol → artemisinic aldehyde → dihydroartemisinic aldehyde → dihydroartemisinic acid → artemisinin。