Taxol Biosynthesis: An Update
- 作者
- Mehri Hezari, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340, USA
- 杂志
- Planta Medica（1997）
- DOI
- 10.1055/s-2006-957684
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇供应不足，其生物合成途径尚未完全阐明，需要解析关键酶促步骤以通过生物方法提高产量。
研究策略
采用无细胞酶学系统逐步解析紫杉醇生物合成途径，结合体内放射性标记实验验证中间体，并通过基于同源序列的 PCR 策略克隆关键酶基因并在大肠杆菌中表达。
核心内容
该研究围绕紫杉醇生物合成途径的解析展开，旨在通过阐明关键酶促步骤以提升紫杉醇产量。研究者采用无细胞酶学系统逐步拆解途径，结合体内放射性标记验证中间体，并利用同源序列PCR策略克隆关键酶基因，在大肠杆菌中表达。主要成果包括首次确定紫杉醇生物合成的前三个酶促步骤，并克隆了编码紫杉二烯合酶的cDNA。经600倍纯化，紫杉二烯合酶为约79 kDa的单体蛋白，其对Mg2+的Km约为0.16 mM，在紫杉茎组织中活性为140 pmol·h⁻¹·g⁻¹。标记的taxa-4(5),11(12)-diene在茎切片中掺入紫杉醇的效率达30%，而紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α-醇的体内掺入率为10-15%，相关中间体在树皮中含量为5-50 μg/kg干重。乙酰转移酶为50 kDa单体，pI约4.7。研究证实，通过系统性无细胞酶学方法可全面定义该途径，识别限速步骤并克隆关键基因，为后续通过过表达这些基因改造红豆杉或微生物宿主、实现紫杉醇高效生物合成提供了理论依据和操作靶点。
创新点
首次确定了紫杉醇生物合成前三个酶促步骤，克隆了编码紫杉二烯合酶的 cDNA，并提出了通过过表达限速步骤基因提高紫杉醇产量的策略。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus brevifolia (太平洋紫杉) | 紫杉醇生物合成 | taxadiene synthase (cDNA) | 紫杉二烯合酶 (taxadiene synthase) | 催化 | 催化香叶基香叶基二磷酸环化为紫杉-4(5),11(12)-二烯，为代谢途径的第一步，约 79 kDa 单体，cDNA 编码 862 氨基酸。 |
| Taxus canadensis (加拿大紫杉) 悬浮培养细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 与 T. brevifolia 的酶在色谱、电泳和动力学上一致。 |
| Taxus 茎和培养细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | 紫杉二烯羟化酶 (taxadiene hydroxylase) | 催化 | 细胞色素 P450 单加氧酶，催化 C-5 羟基化伴随双键迁移，生成紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α-醇。 |
| Taxus canadensis 悬浮培养细胞 | 紫杉醇生物合成 | — | 紫杉二烯醇乙酰转移酶 (taxadienol acetyltransferase) | 催化 | 可溶性 50 kDa 单体，pI 约 4.7，以乙酰 CoA 为底物催化 C-5 乙酰化。 |
| Taxus canadensis 细胞微体 | 紫杉醇生物合成 | — | 后续羟化酶（多个 P450 酶） | 催化 | 催化紫杉二烯醇/乙酸酯等底物的连续羟基化，产物为二醇、三醇、四醇等，具体结构待定。 |
关键发现
- 紫杉二烯合酶经 600 倍纯化，为约 79 kDa 的单体蛋白，Mg2+ Km 约
- 16 mM；紫杉茎组织中该酶活性为 140 pmol·h^-1·g^-1。标记的 taxa-4(5),11(12)-diene 在茎切片中掺入紫杉醇的效率达 30%，其在树皮中含量为 5-10 μg/kg 干重。紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α-醇在树皮中含量 5-10 μg/kg，其酯 25-50 μg/kg，该醇在茎盘中的体内掺入率为 10-15%。乙酰转移酶为 50 kDa 单体，pI 约
- 7。taxadiene synthase cDNA 编码 862 个氨基酸，前体蛋白分子量约 98,000。
研究结论
通过系统逐步的无细胞酶学方法可全面定义紫杉醇生物合成途径，确定限速步骤并克隆关键基因，进而通过过表达这些基因改造 Taxus 或相关微生物，以提高紫杉醇产量。