CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiraidiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts
- 作者
- Juan Guo, Yongjin J. Zhou, Matthew L. Hillwig, Ye Shen, Lei Yang, Yajun Wang, Xianan Zhang, Wujun Liu, Reuben J. Peters, Xiaoya Chen, Zongbao K. Zhao, Luqi Huang
- 单位
- National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, People's Republic of China; Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, People's Republic of China; Department of Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, IA 50011; National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, and Plant Science Research Center of Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, People's Republic of China
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（2013）
- DOI
- 10.1073/pnas.1218061110
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析丹参酮生物合成中miltiradiene下游氧化步骤的关键酶，并在异源微生物中生产ferruginol
研究策略
通过稳定同位素标记验证miltiradiene的中间体地位；采用RNA-seq筛选与二萜合酶共调控的候选CYP基因；体外酶活鉴定CYP76AH1功能；利用模块化代谢工程在酿酒酵母中组装异源生产通路
核心内容
该研究围绕丹参酮生物合成中miltiradiene下游氧化步骤展开，旨在鉴定关键酶并实现异源生产。通过稳定同位素标记证实miltiradiene可被转化为ferruginol和cryptotanshinone，确立其作为生物合成中间体的地位。利用RNA-seq筛选与二萜合酶共调控的候选基因，体外酶活鉴定出CYP76AH1，其催化miltiradiene的四电子氧化级联生成ferruginol，动力学参数kcat为4.4±0.3 s⁻¹，KM为13±3 μM。进一步在酿酒酵母中组装异源生产通路，发现植物CPR对CYP76AH1功能至关重要：共表达SmCPR1的工程菌YJ35产ferruginol达10.5 mg/L，而不含植物CPR的菌株无ferruginol积累且miltiradiene为5.2 mg/L。该工作首次阐明CYP76AH1作为ferruginol合酶的功能，揭示了植物CPR在异源宿主中的必要性，为丹参酮及相关植物二萜的微生物生产奠定了基础。
创新点
首次鉴定CYP76AH1催化miltiradiene的四电子氧化级联生成ferruginol；发现植物CPR对CYP76AH1在酵母中发挥功能至关重要；实现了ferruginol在酵母中的异源生产
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmCPS | Copalyl diphosphate synthase | 催化 | 催化GGPP生成CPP |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmKSL | ent-Kaurene synthase-like | 催化 | 催化CPP生成miltiradiene |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | CYP76AH1 | CYP76AH1 (ferruginol synthase) | 催化 | 催化miltiradiene经四电子氧化生成ferruginol |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmCPR1/SmCPR2 | NADPH-cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 为CYP提供还原力 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸与二萜合成 | BTS1-ERG20 | GGPP synthase-FPP synthase fusion | 催化 | 融合蛋白提高GGPP供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸通路 | tHMG1 | Truncated HMG-CoA reductase | 催化 | 截短的HMGR增强MVA通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 丹参酮生物合成 | CYP76AH1 | CYP76AH1 | 催化 | 异源表达，与植物CPR共表达产生ferruginol |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11U) | 丹参酮生物合成 | AtCPR1 | Arabidopsis thaliana CPR1 | 能量供给 | 染色体整合的拟南芥CPR支持CYP活性 |
| Escherichia coli | MEP通路 | SmCPS/SmKSL | CPS/KSL | 催化 | 用于生成全¹³C标记的miltiradiene |
关键发现
- 稳定同位素标记证实miltiradiene可被转化为ferruginol和cryptotanshinone
- CYP76AH1动力学参数 kcat=4.4±0.3 s⁻¹，KM=13±3 μM，kcat/KM=3.4×10⁵ M⁻¹s⁻¹
- 工程酵母YJ35（含SmCPR1）产ferruginol 10.5 mg/L，YJ33（含SmCPR2）产5.2 mg/L，YJ42（含AtCPR1）产2.1 mg/L，而不含植物CPR的YJ32无ferruginol且miltiradiene为5.2 mg/L
- 此前miltiradiene产量达365 mg/L
研究结论
研究确立了miltiradiene为丹参酮生物合成的中间体，CYP76AH1为ferruginol合酶并催化独特的四电子氧化级联，通过在酵母中共表达CYP76AH1和植物CPR实现了ferruginol的异源生产，为丹参酮及相关植物二萜的微生物生产奠定了基础