Identification of olivetolic acid cyclase from Cannabis sativa reveals a unique catalytic route to plant polyketides
- 作者
- Steve J. Gagne, Jake M. Stout, Enwu Liu, Zakia Boubakir, Shawn M. Clark, Jonathan E. Page
- 单位
- National Research Council- Plant Biotechnology Institute, Saskatoon, SK, Canada S7N 0W9; Department of Biology, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada S7N 5E2
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2012）
- DOI
- 10.1073/pnas.1200330109
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
大麻中橄榄醇酸（OA）的生物合成机制长期不明确，已知III型聚酮合酶（TKS）只能产生橄榄醇和α-吡喃酮副产物而不能合成OA，需鉴定催化OA形成的未知环化酶。
研究策略
对雌花腺毛转录组进行候选环化酶筛选，结合体外酶活测定、透析实验验证反应机制、酵母异源重构验证体内功能、同源建模与定点突变解析催化关键残基、系统发育分析研究进化。
核心内容
该研究从大麻雌花腺毛转录组中鉴定出橄榄醇酸环化酶（OAC），阐明了此前长期不明的大麻素聚酮骨架形成机制。通过体外酶活测定、透析实验、酵母异源重构及定点突变等策略，作者证明OAC是一种约12 kDa、含101个氨基酸的DABB蛋白，自身无聚酮合酶活性，但与III型聚酮合酶TKS共催化时，可将己酰CoA和丙二酰CoA转化为橄榄醇酸（OA）。单独TKS不产生OA，加入OAC后OA生成的同时橄榄醇产量下降；透析实验表明OAC作用于TKS释放的可扩散中间体，催化C2–C7分子内醛醇缩合并保留羧基。在酵母中共表达TKS和OAC并饲喂己酸钠，可产生0.48 mg/L OA。定点突变显示His5、His57、His78完全失活，而部分赖氨酸和天冬氨酸残基突变不影响活性。OAC与拟南芥AtHS1序列同一性为48%，其同源模型具有与细菌DABB环化酶相似的疏水 cleft，系统发育分析显示OAC位于单DABB结构域亚类1a。该工作揭示植物和细菌独立进化出类似的聚酮环化策略，为理解植物聚酮多样性形成提供了新范式，也为在微生物中工程化生产大麻素奠定了分子基础。
创新点
首次鉴定出橄榄醇酸环化酶（OAC），揭示植物III型聚酮合酶需要辅助环化酶协同完成聚酮骨架环化；证明OAC与细菌DABB型环化酶为趋同进化；提出植物聚酮环化酶可能广泛参与天然产物多样性形成。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli（蛋白表达） | 大麻素生物合成 | TKS | 四酮合酶（TKS，type III PKS） | 催化 | 催化己酰CoA与三个丙二酰CoA缩合生成聚酮中间体，单独存在时产生橄榄醇和α-吡喃酮（PDAL、HTAL）副产物，不能合成OA。 |
| Escherichia coli（蛋白表达） | 大麻素生物合成 | OAC | 橄榄醇酸环化酶（OAC） | 催化 | DABB家族蛋白，12 kDa、101个氨基酸，催化C2-C7分子内醛醇缩合保留羧基形成OA；单独无PKS活性。 |
| Saccharomyces cerevisiae（异源重构） | 大麻素生物合成 | TKS | 四酮合酶（TKS） | 催化 | 与OAC共表达于酵母，饲喂己酸钠后产生OA和橄榄醇，无α-吡喃酮。 |
| Saccharomyces cerevisiae（异源重构） | 大麻素生物合成 | OAC | 橄榄醇酸环化酶（OAC） | 催化 | 与TKS共表达时细胞外培养基中检测到0.48 mg/L OA（平均，n=3）；单独TKS仅有痕量OA。 |
| Cannabis sativa（来源） | 大麻素生物合成 | MCS | 丙二酰CoA合成酶（MCS） | 催化 | 体外反应中用于原位再生丙二酰CoA（丙二酸+CoA+ATP）。 |
| Cannabis sativa（来源） | 大麻素生物合成 | Betv1-like | Betv1样蛋白 | 催化 | 作为候选环化酶测试，但与TKS共孵育不能产生OA。 |
| Cannabis sativa（来源） | 大麻素生物合成 | CHI-like | 查尔酮异构酶样蛋白（CHI-like） | 催化 | 作为候选环化酶测试，与TKS共孵育不能产生OA。 |
关键发现
- OAC为12 kDa（101个氨基酸）的DABB蛋白，与TKS共催化将己酰CoA和丙二酰CoA转化为OA
- 体外TKS单独不产生OA，加入OAC后产生OA且橄榄醇产量下降
- 透析实验证明OAC作用于TKS释放的可扩散中间体
- 酵母中共表达TKS和OAC并饲喂己酸钠可产生0.48 mg/L OA（n=3）
- 定点突变显示His5、His57、His78完全失活，His75Ala仅保留1%活性，而Lys4Ala/Lys12Ala/Lys38Ala和Asp45Ala/Asp96Ala仍具活性
- OAC与拟南芥AtHS1序列同一性为48%，同源模型具有与细菌环化酶相似的疏水 cleft
- 系统发育显示OAC位于单DABB结构域亚类1a，与Cannabaceae其他DABB蛋白聚簇。
研究结论
OAC的鉴定阐明了大麻素生物合成中聚酮阶段的关键步骤——C2-C7分子内醛醇缩合保留羧基形成OA，表明植物和细菌独立进化出类似的聚酮环化机制。OAC与TKS的协同作用为植物聚酮生物合成提供了新范式，并为在微生物中工程化生产大麻素奠定了分子基础。