Overcoming heterologous protein interdependency to optimize P450-mediated Taxol precursor synthesis in Escherichia coli
- 作者
- Bradley Walters Biggs, Chin Giaw Lim, Kristen Sagliani, Smriti Shankar, Gregory Stephanopoulos, Marjan De Mey, Parayil Kumaran Ajikumar
- 单位
- Manus Biosynthesis（美国马萨诸塞州剑桥）; 西北大学化学与生物工程系生物技术硕士项目（美国伊利诺伊州埃文斯顿）; 麻省理工学院化学工程系（美国马萨诸塞州剑桥）; 根特大学生物工业与生物催化实验室（比利时）
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（PNAS）（2016）
- DOI
- 10.1073/pnas.1515826113
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
以紫杉醇为模型，解决大肠杆菌中异源细胞色素P450（CYP725A4）介导的加氧反应效率低的问题，重点克服P450表达与上游途径蛋白表达之间的相互干扰，优化紫杉醇前体含氧紫杉烷的合成。
研究策略
基于模块化代谢工程：将上游MEP和环化模块整合至染色体，系统改变P450模块的启动子/拷贝数/融合方式，比较融合与操纵子结构、调节CPR比例、改造P450和CPR的N端序列；利用靶向转录组/蛋白组诊断瓶颈；最后进行2-L生物反应器放大。
核心内容
该研究以紫杉醇前体含氧紫杉烷在大肠杆菌中的合成为模型，系统解决异源细胞色素P450（CYP725A4）介导加氧反应效率低的问题。作者将上游MEP途径与环化模块整合至染色体，通过系统改变P450模块的启动子、拷贝数及融合方式，结合靶向转录组和蛋白组分析诊断瓶颈。关键发现是P450与上游蛋白存在表达相互依赖，P450模块相对表达量超过9时整个途径包括taxadiene合成几乎关闭；非共价融合的操纵子结构优于物理融合嵌合体，低CPR:P450比例（约1:12）反而更有利；适度亲脂性的8RP N端修饰对催化最重要，过度亲水虽提高可溶性却降低转化效率。最优菌株采用五拷贝质粒Trc启动子，P450与CPR以操纵子形式非融合表达，在2-L生物反应器中于25°C获得约570 mg/L总含氧紫杉烷，较之前约116 mg/L提高约5倍，并鉴定到两个新的含氧紫杉烷物种。该工作证明大肠杆菌可作为植物P450介导氧化化学的可行宿主，异源蛋白在蛋白水平上的相互依赖是设计复杂途径时必须考虑的关键因素，为其他P450途径和复杂天然产物的微生物合成提供了可借鉴策略。
创新点
发现P450与上游蛋白存在表达相互依赖；证明非共价融合（operon）优于物理融合（chimera）；发现低CPR:P450比例（约1:12）更有利；发现适度亲脂性N端（8RP）对催化最重要，而过度亲水虽提高可溶性却降低转化；将含氧紫杉烷产量从约116 mg/L提高约5倍至约570 mg/L。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径 | dxs, idi, ispDF | Dxs, Idi, IspDF | 催化 | 上游MEP模块，染色体单拷贝整合于T7启动子下 |
| Escherichia coli | 二萜/taxadiene合成 | GGPPS, TxS | GGPPS（香叶基香叶基焦磷酸合酶）、TxS（taxadiene合酶） | 催化 | 环化模块，染色体整合 |
| Escherichia coli | Taxol前体（含氧紫杉烷）生物合成 | CYP725A4 | CYP725A4（taxadiene 5α-羟化酶/T5aOH） | 催化 | 催化taxa-4(5),11(12)-diene C-5羟基化，为Taxol第一个P450步骤；本研究优化其表达模块 |
| Escherichia coli | Taxol前体（含氧紫杉烷）生物合成 | CPR | 细胞色素P450还原酶（CPR） | 能量供给 | 为CYP725A4提供NADPH来源电子；最优菌株中P450:CPR约12:1，非融合operon表达优于chimera |
| Escherichia coli | Taxol前体（含氧紫杉烷）生物合成 | CYP725A4（N端修饰变体） | 带8RP/MA/2B1 N端修饰的CYP725A4 | 催化 | 8RP修饰催化活性最高；MA和2B1增加可溶性但降低底物转化，推测需膜/疏水界面疏水性 |
关键发现
- 最优菌株（strain 7）采用五拷贝质粒Trc启动子、P450与CPR为operon非融合表达，2-L发酵获得约570 ± 45 mg/L总含氧紫杉烷，较之前约116 mg/L提高约5倍
- P450:CPR蛋白比约12:1
- P450模块相对表达量超过9时途径几乎关闭（包括上游taxadiene）
- T7启动子菌株均不如Trc启动子
- N端8RP修饰优于MA和2B1
- 鉴定到两个新的含氧紫杉烷物种
- 25°C比22/30°C更优。
研究结论
通过平衡P450模块表达强度、采用非融合CPR操纵子以及保留适度膜亲和力的N端修饰，证明大肠杆菌可作为植物P450介导氧化化学的可行宿主；异源蛋白在蛋白水平上的相互依赖是设计复杂途径时必须考虑的关键因素。该策略可为其他P450途径和复杂天然产物微生物合成提供借鉴。