Carnosic acid biosynthesis elucidated by a synthetic biology platform
- 作者
- Codruta Ignea, Anastasia Athanasakoglou, Efstathia Ioannou, Panagiota Georgante, Fotini A. Trikka, Sofia Loupassaki, Vassilios Roussis, Antonios M. Makris, Sotirios C. Kampranis
- 单位
- Department of Biochemistry, School of Medicine, University of Crete; Department of Pharmacology and Chemistry of Natural Products, School of Pharmacy, University of Athens; Institute of Applied Biosciences- Centre for Research and Technology Hellas; Mediterranean Agronomic Institute of Chania
- 杂志
- Proceedings of the National Academy of Sciences（2016）
- DOI
- 10.1073/pnas.1523787113
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明鼠尾草酸及其相关二萜类化合物在西班牙鼠尾草（Salvia pomifera）和迷迭香（Rosmarinus officinalis）中的生物合成途径，并展示合成生物学平台用于植物天然产物途径解析的潜力。
研究策略
利用模块化酵母萜烯生产平台，结合腺毛转录组测序数据，通过底盘工程（过表达HEM3、优化前体供给）提高产率，系统筛选和功能表征细胞色素P450酶，重建鼠尾草酸生物合成途径。
核心内容
本研究利用模块化酵母萜烯生产平台，结合西班牙鼠尾草和迷迭香的腺毛转录组数据，系统解析了鼠尾草酸的完整生物合成途径。研究人员构建了包含上游二萜前体供给的酵母底盘，通过转录组筛选和异源表达，鉴定并功能表征了四个细胞色素P450酶：CYP76AH24为双功能单加氧酶，催化C-12和C-11连续氧化；CYP71BE52催化C-2α氧化生成salviol；CYP76AK6与CYP76AK8则负责C-20的连续氧化，最终生成鼠尾草酸和pisiferic acid。这些酶的联合活性可以解释该植物中主要二萜化合物的所有氧化步骤。在底盘优化方面，通过表达ERG20-F96C与柯巴基二磷酸合酶的融合蛋白，使中间产物ferruginol产量从2.7 mg/L提高到8.4 mg/L；进一步过表达血红素合成基因HEM3后，产量再提升至21.2 mg/L，底物转化率从32%升至62%，最终鼠尾草酸摇瓶产量约为1 mg/L。该工作不仅完整阐明了鼠尾草酸的生物合成路径，也展示了模块化酵母平台在植物天然产物途径解析中的高效筛选能力。
创新点
开发了模块化酵母平台作为功能基因组筛选工具；发现CYP76AH24为双功能单加氧酶（催化C-12和C-11连续氧化）；首次鉴定了参与鼠尾草酸途径的四个CYP酶（CYP76AH24、CYP71BE52、CYP76AK6和CYP76AK8）并阐明其分工；通过底盘优化使ferruginol产量提高约8倍（从2.7 mg/L增至21.2 mg/L）。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (AM102) | 甲羟戊酸途径/萜烯前体合成 | HMG2(K6R) | HMG-CoA还原酶（截短型） | 催化 | 编码截短的HMG-CoA还原酶，增强MVA通量，提高萜烯前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102) | 二萜前体合成 | ERG20-CcGGPPS (融合) | 法尼基焦磷酸合酶/牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶融合蛋白 | 催化 | 用于合成GGPP，为二萜提供底物 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102) | 二萜骨架合成 | SfCDS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP环化生成(+)-copalyl diphosphate (CPP) |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102) | 二萜骨架合成 | SpMilS | 弥罗松酚合酶（miltiradiene synthase） | 催化 | 催化CPP环化生成miltiradiene |
| Saccharomyces cerevisiae (AM119) | 血红素生物合成 | HEM3 | 胆色素原脱氨酶 | 催化 | 过表达以增强血红素供给，提高CYP酶活性 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | 二萜修饰（鼠尾草酸途径） | CYP76AH24 | CYP76AH24（双功能单加氧酶） | 催化 | 催化C-12和C-11羟基化，将abietatriene转化为ferruginol及11-羟基ferruginol等 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | 二萜修饰（鼠尾草酸途径） | CYP71BE52 | CYP71BE52（salviol合酶） | 催化 | 催化ferruginol C-2α氧化生成salviol |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | 二萜修饰（鼠尾草酸途径） | CYP76AK6 | CYP76AK6 | 催化 | 催化C-20连续氧化，生成鼠尾草酸和pisiferic acid等 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | 二萜修饰（鼠尾草酸途径） | CYP76AK8 | CYP76AK8 | 催化 | 迷迭香中CYP76AK6的同源物，功能类似，催化C-20氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | 二萜修饰（鼠尾草酸途径） | CYP76AH4 | CYP76AH4（迷迭香铁锈醇合酶） | 催化 | 与CYP76AH24同源，也具有C-11羟基化活性 |
| Saccharomyces cerevisiae (AM102/AM119) | P450电子传递 | CPR2 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为CYP酶提供电子，来自杨树 |
关键发现
- 鉴定了CYP76AH24、CYP71BE52、CYP76AK6和CYP76AK8四个细胞色素P450酶，其组合活性解释了鼠尾草酸途径中所有关键氧化事件。CYP76AH24为双功能酶，催化C-12和C-11羟基化，与CYP76AH4类似
- CYP71BE52催化ferruginol C-2α氧化生成salviol
- CYP76AK6/8催化C-20连续氧化生成鼠尾草酸和pisiferic acid。通过表达erg20p(F96C)-SfCDS融合蛋白，ferruginol产量从2.7 mg/L提高到8.4 mg/L（3倍）
- 随后过表达HEM3使产量进一步提高到21.2 mg/L（2.5倍），底物转化率从32%提高到62%。鼠尾草酸摇瓶产量约1 mg/L。动力学参数：CYP76AH24对ferruginol的Kcat=6.11 min^-1，KM=45.84 μM
- 对miltiradiene的Kcat=1.9 min^-1，KM=72.63 μM。CYP76AH24与CYP76AH4对ferruginol的KM分别为45.8±9.4 μM和49.5±11.1 μM。CYP76AH24与CYP76AH1有80%氨基酸同一性，与CYP76AH4有91%同一性
- CYP76AK8与CYP76AK6有75%相似性。
研究结论
四个CYP酶（CYP76AH24、CYP71BE52、CYP76AK6和CYP76AK8）的联合活性足以解释西班牙鼠尾草和迷迭香中主要二萜（鼠尾草酸、鼠尾草酚、salviol、pisiferic acid等）的所有氧化步骤，建立了鼠尾草酸生物合成的完整途径，并证明了模块化酵母平台在植物天然产物途径解析中的高效性和可扩展性。