Novel Tryptophan Metabolism by a Potential Gene Cluster That Is Widely Distributed among Actinomycetes
- 作者
- Taro Ozaki, Makoto Nishiyama, Tomohisa Kuzuyama
- 单位
- Biotechnology Research Center, the University of Tokyo
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2013）
- DOI
- 10.1074/jbc.M112.436451
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
放线菌中广泛分布着一类包含吲哚异戊烯基转移酶基因和FMO基因的潜在基因簇（Type B），其功能未知，常规培养条件下产物不表达或表达极弱，难以鉴定其代谢产物。
研究策略
采用基于基因剂量效应的异源表达策略：将天蓝色链霉菌A3(2)中的SCO7467和SCO7468基因导入变铅青链霉菌TK23，通过LC-MS/MS分析新产生的代谢物；随后对重组酶进行体外生化表征以阐明完整生物合成途径。
核心内容
放线菌基因组中广泛分布着一类包含吲哚异戊烯基转移酶基因和FMO基因的潜在基因簇，但其代谢产物在常规培养条件下不表达或表达极弱，功能长期未知。本研究采用基因剂量效应的异源表达策略，将天蓝色链霉菌A3(2)中的SCO7467和SCO7468基因导入变铅青链霉菌TK23，经LC-MS/MS分析鉴定出新化合物5-二甲基烯丙基吲哚-3-乙腈（5-DMAIAN），并从2升培养液中分离得到8.9 mg产物。体外生化表征阐明其生物合成途径：L-色氨酸先经SCO7467催化生成5-二甲基烯丙基-L-色氨酸（5-DMAT），再经SCO7468转化为5-二甲基烯丙基吲哚-3-乙醛肟（5-DMAIAOx），最后由未知脱水酶生成5-DMAIAN。SCO7467是首个被确定的催化色氨酸C-5位异戊烯基化的放线菌异戊烯基转移酶，对L-色氨酸的Km为80±6 μM；SCO7468则是首次报道的催化醛肟形成的FMO，其还能以N-羟基色氨酸为中间体缓慢催化L-色氨酸生成吲哚-3-乙醛肟。这一发现揭示了一条新颖的L-色氨酸代谢途径，为放线菌中广泛存在的异戊烯基吲哚衍生物的生物合成提供了重要见解。
创新点
['首次利用简单的异源表达（基因剂量效应）策略成功鉴定了一个沉默潜在基因簇的产物5-DMAIAN', '发现并表征了第一个催化L-色氨酸C-5位异戊烯基化的放线菌异戊烯基转移酶SCO7467', '首次报道FAD依赖性单加氧酶（FMO）催化醛肟形成反应（5-DMAT→5-DMAIAOx）', '阐明了一条新颖的L-色氨酸代谢途径，为放线菌中异戊烯基吲哚衍生物的生物合成提供了见解']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces lividans TK23 | 5-DMAIAN生物合成 | SCO7467 | 5-二甲基烯丙基色氨酸合酶（吲哚异戊烯基转移酶） | 催化 | 异源表达宿主，利用基因剂量效应鉴定新代谢产物；催化L-色氨酸C-5位异戊烯基化生成5-DMAT |
| Streptomyces lividans TK23 | 5-DMAIAN生物合成 | SCO7468 | FAD依赖性单加氧酶（FMO） | 催化 | 与SCO7467共表达时促进5-DMAIAN生成；催化5-DMAT转化为5-DMAIAOx，也能以L-色氨酸为底物生成IAOx |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | SCO7467 | N端His₈标签的SCO7467重组蛋白 | 催化 | 用于体外生化表征和动力学研究，确定其异戊烯基转移酶活性及底物特异性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | SCO7468 | N端His₈标签的SCO7468重组蛋白 | 催化 | 用于体外生化表征，证明其为FAD结合蛋白并以NADPH为辅因子催化醛肟形成 |
关键发现
- 通过异源表达和体外生化实验，鉴定出新化合物5-二甲基烯丙基吲哚-3-乙腈（5-DMAIAN），并阐明其生物合成途径：L-色氨酸经SCO7467（异戊烯基转移酶）催化生成5-二甲基烯丙基-L-色氨酸（5-DMAT），再经SCO7468（FMO）转化为5-二甲基烯丙基吲哚-3-乙醛肟（5-DMAIAOx），最后由未知脱水酶生成5-DMAIAN。SCO7467对L-色氨酸的Km为80±6 μM，对DMAPP的Km为50±2 μM，kcat为0.40±0.1 s⁻¹
- SCO7468对5-DMAT的Km为0.57±0.1 μM，kcat为(8.2±0.7)×10⁻³ s⁻¹，对L-色氨酸的Km为(3.3±0.7)×10³ μM，kcat为(5.2±0.4)×10⁻³ s⁻¹。从2升培养液中分离得到8.9 mg 5-DMAIAN，其分子式为C₁₅H₁₆N₂（HRMS m/z 225.1385 [M+H]⁺）。此外，SCO7468还可催化L-色氨酸缓慢生成吲哚-3-乙醛肟（IAOx），并以N-羟基色氨酸为反应中间体。
研究结论
本研究阐明了一条由SCO7467和SCO7468介导的新的L-色氨酸代谢途径，该途径负责5-DMAIAN的生物合成。SCO7467是首个确定催化色氨酸C-5异戊烯基化的放线菌异戊烯基转移酶，SCO7468是首次发现的催化醛肟形成的FMO。该发现为放线菌中广泛存在的异戊烯基吲哚衍生物的生物合成提供了重要见解。