A Lettuce (Lactuca sativa) Homolog of Human Nogo-B Receptor Interacts with cis-Phenyltransferase and Is Necessary for Natural Rubber Biosynthesis
- 作者
- Yang Qu, Romit Chakrabarty, Hue T. Tran, Eun-Joo G. Kwon, Moonhyuk Kwon, Trinh-Don Nguyen, Dae-Kyun Ro
- 单位
- Department of Biological Sciences, University of Calgary, Calgary, Alberta T2N 1N4, Canada
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2015）
- DOI
- 10.1074/jbc.M114.616920
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然橡胶（顺式-1,4-聚异戊二烯）在植物中的生物合成机制长期不明，尤其是莴苣等菊科植物中橡胶合酶复合物的分子组成和功能尚不清楚。
研究策略
以莴苣为模型植物，通过橡胶颗粒蛋白质组学鉴定出CPTL2（一种缺失保守CPT催化基序的顺式异戊烯基转移酶类似蛋白），结合RNAi沉默、亚细胞定位（烟草和酵母）、酵母双杂交、体外酶活测定及多反应监测（MRM）等手段，系统研究CPTL2与常规CPT3的相互作用及其在天然橡胶生物合成中的必要性。
核心内容
该研究以莴苣为模型，通过橡胶颗粒蛋白质组学鉴定出一个缺失保守催化基序的顺式异戊烯基转移酶类似蛋白CPTL2，并借助RNAi沉默、酵母双杂交、亚细胞定位及体外酶活测定等手段，系统解析了其与常规CPT3的相互作用及在天然橡胶合成中的功能。结果显示，CPTL2在胶乳中优势表达，开花期表达量比叶片高32倍；13个RNAi株系中6个株系的橡胶含量降至对照的5%以下，且橡胶丰度与CPTL2转录水平呈强线性相关。酵母双杂交证实CPTL2与CPT3互作，荧光定位表明共表达可将细胞质中的CPT3重新锚定至内质网。然而，酵母中仅共表达CPTL2/CPT3虽能增强短链cis-多异戊二烯合成，却无法合成高分子量天然橡胶（莴苣中重均分子量约1.50百万g/mol），提示还需其他胶乳组分参与。此外，CPTL1/CPT1负责dolichol合成，表明莴苣经基因复制实现了橡胶与初级代谢的功能分化，CPTL2作为支架蛋白是橡胶生物合成所必需的关键组分。
创新点
首次报道莴苣中CPTL2作为支架蛋白与CPT3形成异源复合物并锚定于内质网；证明CPTL2是天然橡胶生物合成所必需的组分，而酵母中仅共表达CPTL2/CPT3不足以合成高分子量天然橡胶；发现莴苣中CPTL1/CPT1负责初级代谢dolichol合成，而CPTL2/CPT3专门用于橡胶合成，揭示基因复制导致功能分化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 莴苣 (Lactuca sativa) | 天然橡胶生物合成 | CPTL2 | CPTL2 | 区室化 | 缺乏CPT保守催化基序，作为支架蛋白将CPT3锚定于内质网，RNAi沉默后橡胶含量降至5%以下 |
| 莴苣 (Lactuca sativa) | 天然橡胶生物合成 | CPT3 | CPT3 | 催化 | 在胶乳中特异表达，与CPTL2互作，催化顺式异戊二烯链延伸 |
| 莴苣 (Lactuca sativa) | dolichol生物合成 | CPTL1 | CPTL1 | 区室化 | 与CPT1形成复合物，瞬时表达及酵母实验显示其将CPT1锚定于内质网并增强活性 |
| 莴苣 (Lactuca sativa) | dolichol生物合成 | CPT1 | CPT1 | 催化 | 广泛表达，与CPTL1协同催化合成dolichol类短链顺式多异戊二烯 |
| 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 异戊二烯代谢 | CPTL2, CPT3 | CPTL2, CPT3 | 区室化 | 在酵母中对数期共定位至内质网，稳定期定位于脂滴；微粒体实验显示可增强短链cis-多异戊二烯合成但无橡胶生成 |
| 烟草 (Nicotiana benthamiana) | 异戊二烯代谢 | CPTL2, CPT3 | CPTL2, CPT3 | 区室化 | 瞬时共表达时CPT3从细胞质重新定位到内质网，验证CPTL2的锚定作用 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 重组蛋白表达 | CPTL2, CPT3, CPTL1, CPT1 | CPTL2, CPT3, CPTL1, CPT1 | 催化 | 用于重组蛋白表达及抗体制备，但未用于体外橡胶合成 |
关键发现
- 在莴苣品种Mariska和Ninja中天然橡胶重均分子量分别为1.50±0.07和1.45±0.03百万g/mol，多分散性为1.53±0.06和1.49±0.10
- CPTL2在胶乳中优势表达，开花期胶乳中表达量比叶片高32倍
- 13个CPTL2-RNAi转基因株系中，6个株系（RNAi-a1, -a3, -b1, -b3, -c2, -c4）的橡胶含量降至对照的5%以下，其CPTL2转录水平降至对照的3-15%
- NR丰度与CPTL2转录水平呈强线性相关
- 酵母双杂交证明CPTL2与CPT3相互作用
- 荧光定位显示在烟草表皮细胞和对数期酵母中，CPTL2共表达使细胞质CPT3重新定位至内质网
- 酵母微粒体中CPTL2/CPT3共表达可增强短链cis-多异戊二烯合成，但无法合成高分子量天然橡胶
- CPTL1/CPT1共表达在体外高效合成dolichol类产物。
研究结论
CPTL2是莴苣天然橡胶生物合成所必需的支架蛋白，通过与CPT3形成异源蛋白复合物将其锚定于内质网，从而在体内参与橡胶合成；但仅靠酵母中共表达CPTL2和CPT3不足以在体外合成高分子量天然橡胶，提示还需其他胶乳组分或特定的纳米结构。CPTL1/CPT1则负责普遍的dolichol合成，表明莴苣中发生了基因复制并产生了功能特化的橡胶合成模块。